Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH) es una limitación significativa para los pacientes que reciben trasplante de células madre hematopoyéticas como terapia para deficiencias hematológicas y neoplasias malignas. La EICH aguda ocurre cuando los células T del donante reconocen los tejidos huésped como un antígeno extraño y montan una respuesta inmune al huésped. Los tratamientos actuales implican medicamentos inmunosupresores tóxicos que hacen que los pacientes sean susceptibles a la infección y la recurrencia. Por lo tanto, hay investigaciones en curso para proporcionar una terapia aguda de la EICH que puede apuntar eficazmente a las células T del donante y reducir los efectos secundarios. Gran parte de este trabajo preclínico utiliza el modelo murino génico GVHD (xenoGVHD) que permite la prueba de terapias inmunosupresoras en células humanas en lugar de células murinas en un sistema in vivo. Este protocolo describe cómo inducir xenoGVHD y cómo cegar y estandarizar la puntuación clínica para garantizar resultados consistentes. Además, este protocolo describe cómo utilizar la PCR digital para detectar células T humanas en tejidos de ratón, que posteriormente se pueden utilizar para cuantificar la eficacia de las terapias probadas. El modelo xenoGVHD no sólo proporciona un modelo para probar las terapias de la EICH, sino cualquier terapia que pueda suprimir las células T humanas, que luego podrían aplicarse a muchas enfermedades inflamatorias.
Introducción
El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) se ha convertido en tratamiento de rutina para pacientes que sufren de neoplasias malignas hematológicas como leucemia con mal pronóstico. Una complicación significativa del THCt es la enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH). Un estudio de 2012 informó que la EICH aguda se desarrolló en el 39% de los pacientes con HSCT que recibieron trasplantes de donantes hermanos y el 59% de los pacientes que recibieron trasplantes de donantes no relacionados1. La EICH aguda ocurre cuando las células T derivadas del donante atacan los órganos del receptor. La única terapia exitosa para la EICH esel tratamiento con fármacos altamente inmunosupresores 2, que son altamente tóxicos y aumentan el riesgo de infección y recurrencia tumoral. Así, a pesar de las mejoras que se han realizado en la supervivencia aguda de la EICH en los últimos años3,4,5, todavía existe una necesidad crítica de terapias mejoradas de la EICH con toxicidad mínima que promuevan la remisión a largo plazo.
El objetivo general de los siguientes métodos es inducir y puntuar la EICH xenogénica (xenoGVHD). El modelo xenoGVHD fue desarrollado como una herramienta para inducir la EICH aguda con células humanas enlugar de células murinas que permiten una traducción más directa de la investigación preclínica de la EICH a los ensayos clínicos 6. Este modelo consiste en inyectar por vía intravenosa células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en ratones NOD-SCID IL-2R-null (NSG) que se irradian subletalmente. Las células T humanas inyectadas son activadas por células que presentan antígeno humano (ACC) que presentan antígeno murno y las células T activadas migran a tejidos distantes resultando en inflamación sistémica y, en última instancia, muerte6,7, 8 , 9 , 10. La patología y progresión de la enfermedad en el modelo xenoGVHD imitan de cerca la EICH aguda humana. Específicamente, las células T humanas patógenas son reactivas a las principales proteínas del complejo de histocompatibilidad murina (MHC), que es similar a la aleactividad de las células T en la EICH6humana,9. La principal ventaja del modelo xenoGVHD sobre el modelo MHC-desajuste del ratón, el otro modelo GVHD ampliamente utilizado, es que permite la prueba de terapias en células humanas en lugar de células murinas. Esto permite probar productos que se pueden traducir directamente a la clínica sin ninguna modificación porque están hechos para apuntar a las células humanas. Recientemente, este modelo se ha utilizado para probar un anticuerpo humano anti-IL-211,células T reguladoras timmicas humanas (Tregs)12 y células madre mesenquimales humanas13 como tratamientos potenciales para la EICH aguda. En un contexto más amplio, este modelo se puede utilizar como un ensayo de supresión in vivo para cualquier droga o tipo de célula que pueda suprimir la actividad de las células T humanas. Por ejemplo,14 utilizaron el modelo xenoGVHD para estudiar el efecto del bloqueo de la integrina -V-8 en la actividad supresora de Treg in vivo. Por lo tanto, el modelo xenoGVHD puede proporcionar información sobre el mecanismo de cualquier terapia dirigida a los células T en un entorno in vivo.
Un método adicional descrito en este protocolo es cómo detectar células T humanas en tejidos de ratón utilizando reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). El objetivo de este método es ofrecer una herramienta para cuantificar la migración y proliferación de células T en los tejidos diana, que miden la eficacia de las terapias inmunosupresoras que se están probando en este modelo. dPCR es un método relativamente novedoso para la cuantificación de ácidos nucleicos15. Brevemente, la mezcla de reacción PCR se divide en particiones que contienen pequeños números de la secuencia de destino o ningún objetivo en absoluto. La secuencia de destino se amplifica y se detecta mediante colorantes intercaladores de ADN o sondas fluorescentes específicas del objetivo. dPCR cuantifica el número de copias de la secuencia de destino en función de la fracción de particiones positivas y las estadísticas de Poisson15,16. La detección de células T con dPCR requiere mucho menos tejido en comparación con otros métodos alternativos, como la citometría de flujo y la histología, y se puede realizar en tejido congelado o fijo. dPCR no requiere una curva estándar para determinar los números de copia, ni se requieren réplicas técnicas. Esto reduce la cantidad de ADN de reactivo y plantilla necesario para dPCR en comparación con el PCR cuantitativo tradicional (qPCR)16. La partición de la reacción pcR en subreacciones en dPCR concentra eficazmente los objetivos17. Por lo tanto, dPCR es principalmente una herramienta para la detección de objetivos raros en una gran cantidad de ADN no objetivo. Por ejemplo, el dPCR se utiliza para detectar la contaminación bacteriana en la leche18,identificar mutaciones raras en el gen del receptor de estrógeno19y detectar adn tumoral circulante en la sangre de los pacientes20. En este protocolo, dPCR sirve como una herramienta eficiente para detectar y cuantificar células T humanas en tejidos de ratones con xenoGVHD.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con ratones se realizaron de conformidad y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kansas Medical Center. Todas las muestras de sangre humana sana fueron obtenidas bajo consentimiento informado y con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad de Kansas.
1. Irradiación de ratones NSG
- Un día antes de la inyección de PBMC, irradiar ratones NSG de 8 a 12 semanas (se pueden utilizar ambos sexos). En un gabinete de bioseguridad estéril, coloque ratones en una jaula de pastel esterilizado o microisolator. Irradiar ratones en una fuente Cs137 o un pequeño irradiador animal (por ejemplo, RS 2000) con una dosis total de 150 cGy con rotación lenta para asegurar una irradiación uniforme.
- Coloque ratones en jaulas limpias en un gabinete de bioseguridad estéril.
2. Preparación de PBMC humano para inyección
- Recoger suficiente sangre humana sana para aislar 1.1 x 107 PBMC por ratón. Diluir la sangre heparinizada en un volumen igual de 2% de suero bovino fetal (FBS) en solución salina tamponada de fosfato (PBS).
NOTA: Con este protocolo, el rendimiento de PMBC es generalmente 0.5–1 x 107 por 10 mL de sangre entera. Cada ratón recibirá 107 PBMC en 100 s de PBS. El extra de 1 x 106 en 10 l por ratón garantiza que cada ratón reciba la dosis completa de PBMC, en caso de que haya algún problema con el llenado de jeringas. - Añadir 15 ml de densidad de separación de linfocitos medio gradiente (por ejemplo, Ficoll) a un tubo cónico de 50 ml y luego superponer cuidadosamente hasta 25 ml de sangre diluida en la parte superior del gradiente de densidad. Centrifugar el tubo que contiene el gradiente de densidad y la sangre diluida a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente sin freno.
- Cosecha la interfaz PBMC en 10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante.
- Afloje el pellet moviendo el tubo y resuspenda en 10 ml de PBS para lavar el PBMC. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min.
- (Opcional) Deseche los glóbulos rojos sobrenadant es y la lyse en el pellet celular agregando un volumen de tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio (ACK) que sea igual al volumen del pellet. Resuspenda suavemente el pellet y gire el tubo durante 30–60 s. Llene el tubo con medios RPMI libres de suero y centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de PBS. Cuente las células usando la exclusión azul de trypan con un hemocitómetro y un microscopio.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células a 1 x 108 células/ml en PBS.
3. Inyección retro-orbital de PBMC humano en ratones21
- Coloque una cámara de anestesia en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad. Precargue la cámara de anestesia con 5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno durante 5 min.
- Reduzca el isoflurano al 2% y coloque ratones de la misma jaula en la cámara de anestesia. Una vez que los ratones pierden la enderezación, anestesian a los ratones durante 5 minutos en la cámara. Durante este tiempo, rellene previamente la jeringa con 100 l (1 x 107 células) de suspensión celular.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento con la nariz en un cono nasal para mantener la anestesia. Compruebe la pérdida de conciencia pellizcando una almohadilla para los pies y comprobando si hay falta de reflejo.
- Sujeta el ratón con el pulgar y el dedo medio. Inserte la aguja de 28 G 1/2 en la aguja con el bisel hacia abajo lateralmente hasta el canthus medial, a través de la membrana conjuntival hasta que se alcance la parte posterior del ojo. Retraiga ligeramente la aguja e inyecte lentamente 100 ml de células (1 x 107 células).
- Retraiga completamente la aguja y deseche correctamente la jeringa y la aguja. Cierre el párpado y aplique una presión leve en el lugar de la inyección con una esponja de gasa.
- Examine el lugar de inyección en busca de hinchazón u otro trauma visible. Permita que el ratón recupere la conciencia en una jaula estéril forrada con toallas de papel para evitar la aspiración de ropa de cama antes de mudarse a la jaula de casa. Después de que se haya detenido cualquier sangrado, aplique una sola gota de proparacaína en el ojo para la analgesia.
NOTA: La inyección de vena de cola es un método alternativo de inyección intravenosa de PBMC para este protocolo descrito por Macholz y otros22.
4. Puntuación clínica de la EICH aguda en ratones (Figura 1)23
- Mida la puntuación de la EICH cada dos días hasta que los ratones alcancen una puntuación de un 2 y luego todos los días hasta el día del sacrificio.
- Coloque la jaula en una campana de flujo laminar, retire la comida y el agua y vuelva a colocar la tapa. Puntuar la actividad mediante la observación de ratones durante 5 minutos y asignar puntuaciones de la siguiente manera: 0 - ratón comienza a caminar en un par de minutos y sigue caminando alrededor de la jaula, 1 - ratón toma un par de minutos para levantarse y camina lentamente alrededor de la jaula, 2 o ratón no se levanta en 5 minutos y sólo camina cuando se toca.
- Pesar cada ratón en un vaso de vidrio y dar una puntuación de pérdida de peso: 0 á <10% de cambio, 1 x 10–25% de cambio y 2 s >25% de cambio.
- Mientras el ratón todavía está en el vaso de precipitados, inspeccione la postura: 0 o normal, 1 o encorvado en reposo, 2o encorvado afecta el movimiento; texturade piel: 0o normal, 1o ruffling leve a moderado, 2o ruffling severo, y la integridad de la piel: 0o normal, 1o de escala de patas/cola, 2 áreas obvias de piel denuded (mira las orejas, la cola y las patas para escalar).
- Con cinco categorías y una puntuación de 0-2 para cada categoría, un ratón puede alcanzar una puntuación máxima de 10. Cuando un ratón alcanza una puntuación de 7 o más o alcanza los 42 días después de la inyección, eutanasia ratón a través de la eutanasia CO2 u otro método aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local.
NOTA: Para garantizar la precisión de los resultados, la puntuación es realizada por un investigador que está cegado a los grupos de tratamiento24. Además, aunque >20% de la pérdida de peso corporal es el punto final humano recomendado para muchos protocolos IACUC, con la justificación adicional se puede obtener la aprobación IACUC de este protocolo.
5. Recolección de tejidos para ADN genómico de ratones eutanasiados y ADN genómico aislante
- Diseccionar ratones usando herramientas quirúrgicas estériles. Corte un pequeño trozo de tejido de aproximadamente 3 mm x 0,5 mm de tamaño de un órgano de interés, por ejemplo, pulmón, hígado o bazo. Pesar la muestra de tejido y colocar la pieza de tejido en un tubo estéril de 1,5 ml. Si recoge múltiples tejidos, lave las herramientas con etanol entre el corte de cada órgano.
- Congele los tejidos sumergiendo los tubos que contienen el tejido en nitrógeno líquido hasta que deje de burbujear y almacenarlos en -80 oC durante la noche. Descongelar las muestras de tejido y lijarlas de acuerdo con un kit de aislamiento de ADN genómico (ADN)
- Aísle el ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante como se describe en el kit. Asegúrese de tener en cuenta la cantidad de tejido que se procesó por microlitro de ADN inteligente eludado (mg/L).
NOTA: Los tejidos congelados se pueden almacenar a -80 oC para su procesamiento en un momento posterior.
6. Cuantificación de células T humanas utilizando PCR digital (Figura2)
- Preparar las reacciones de PCR digitales de acuerdo con el protocolo para los dedos de unión de ADN para la máquina PCR digital que se está utilizando. Utilice las siguientes imprimaciones específicas para el ADN genómico humano de épsilon CD3 (secuencia de referencia NCBI: NG_007383.1); Primer delantero: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Primer Inverso: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Estos imprimadores producirán una sola banda de 105 bp.
NOTA: Añadir 0,5 l de una enzima de restricción, como HindIII, a cada reacción para digerir el ADN genómico. Asegúrese de probar diferentes diluciones de ADNr para optimizar la separación de gotas positivas y negativas. Además, un subconjunto de células T infiltrantes puede ser células T reguladoras no patógenas. Estas células se pueden cuantificar usando imprimadores adicionales para marcadores de células T reguladores. - Llevar a cabo la reacción de PCR digital en las siguientes condiciones: Tapa a 105 oC, 95 oC durante 10 min (1 ciclo); 95 oC para 30 s, rampa de 2 oC/s y 55 oC durante 1 min, rampa 2 oC/s (40 ciclos); 72 oC durante 10 min, 12 oC de retención.
NOTA: Es posible que estos parámetros deba ajustarse en función del equipo PCR digital. - Adquiera datos de PCR digitales con software de análisis. Reporte los datos como números de copias por mg de tejido utilizando la siguiente ecuación: (número de copias/L) x (L de ADNG en reacción) x (factor de dilución)/(mg de tejido/L de ADNr total)
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los ratones NSG de 8-12 semanas de edad de ambos sexos que recibieron PBMC humano comenzaron a mostrar signos clínicos de EICH alrededor del día 10 después de la inyección en comparación con los ratones de control negativo que recibieron PBS solamente (Figura1A). Los ratones XenoGVHD tuvieron una mediana de supervivencia de 23,5 días (Figura1B). Con pcR digital, se podrían detectar células T humanas positivas de CD3 epsilon en la...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La progresión de la enfermedad es generalmente consistente en el modelo xenoGVHD, incluso con la inyección de PBMC de diferentes donantes, por lo que se pueden combinar múltiples experimentos. Los pasos clave necesarios para mantener esta consistencia son la técnica de inyección i.v. adecuada, cegadora y puntuación consistente. Un estudio realizado por Nervi et al.25 demostró que en comparación con la inyección intravenosa de vena de cola, las inyecciones retro-orbitales de PBMC dieron lugar a un ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer al laboratorio de Lane Christenson por proporcionar la máquina pcR digital utilizada en estos experimentos y por el soporte técnico proporcionado. También nos gustaría agradecer al Dr. Thomas Yankee por su orientación y tutoría. Estos estudios fueron apoyados por la Fundación De la Familia Tripp.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos eppendorf de 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Pipeta serológica de 10 mL | VWR International | 89130-898 | |
| 10 mL BD Vacutainers - Verde tapado con heparina sódica | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µ L Puntas de pipeta Ranin | Rainin 17001118 | No utilice otras pipetas ni puntas de pipeta para la generación de gotas | |
| Tubo cónico de 50 ml | VWR International | 89039-656 | |
| Placa ddPCR de 96 pocillos | Bio-Rad | 12001925 | |
| Tampón de lisado ACK (cloruro de amonio-potasio) | Lonza | 10-548E | |
| Toallitas con alcohol | Fisher Scientific | 6818 | |
| Cámara de anestesia | World Precision Instruments | EZ-178 | Proporcionado por el animalario |
| Máquina de anestesia | Parkland Scientific | PM1002 | Proporcionado por el animalario |
| BD Vacutainer Safety-Lok Juego de recolección de sangre | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartuchos y juntas para el generador de gotas QX100/QX200 | Bio-Rad | 1864007 | |
| Libre de ADNasa y ARNasa H2O de grado molecular | Technologies | 1811318 | |
| Alcohol etílico, puro, a prueba de 200 grados, para biología molecular | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Suero fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Jeringa de insulina | Fisher Scientific | ||
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Proporcionado por Animal |
| Facility Nitrógeno líquido | N/A | N/A | |
| Irradiador de ratón Jaula de pastel | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Tiene capacidad para 11 ratones |
| Cinta de papel suave Nexcare (también conocida como cinta quirúrgica de microporos 3M / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| pipeta P1000 | MidSci | A-1000 | |
| pipeta P200 | MidSci | A-200 | |
| Lámina perforable Termosellado | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipeta Gilson Macroman | Fisher Scientific | ||
| Pipeta múltiple Pipet-Lite L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | No utilice otras pipetas ni puntas de pipeta para la generación de gotas |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Placas qPCR VWR | International | 89218-292 | |
| QX200 Sistema de PCR digital por gotas | Bio-Rad | 12001925 | Incluye generador de gotas, lector de gotas, ordenador portátil, software, consumibles de componentes asociados, para aplicaciones de PCR digital EvaGreen o basadas en sondas |
| QX200 Aceite de generación de gotas para EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad 1864033 | ||
| Sellado de placas sin RNasa ni DNasa | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Almohadillas de gasa estériles (2" x 2", 12 capas) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Solución salina tamponada con fosfato estéril | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Depósito estéril | VWR International | 89094-662 | |
| Tijeras quirúrgicas | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| pinza quirúrgica | Kent Scientific | INS650914-4 |
Referencias
- Jagasia, M., et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation. Blood. 119 (1), 296-307 (2012).
- Bolanos-Meade, J., et al. Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802. Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).
- Gooley, T. A., et al. Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Hahn, T., et al. Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).
- Khoury, H. J., et al. Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era. Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells. Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).
- Ito, R., et al. Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice. Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).
- Kawasaki, Y., et al. Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).
- Ito, R., et al. A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8. T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).
- Trotta, E., et al. A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism. Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).
- Dijke, I. E., et al. Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells. American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).
- Huang, F., et al. Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals. Frontiers in Immunology. 8, 68(2017).
- Stockis, J., et al. Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Sykes, P. J., et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Ma, H., et al. Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR. Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).
- Vitale, S. R., et al. An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA. Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).
- Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies. Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).
- Weisdorf, D. J., et al. Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).
- Nervi, B., et al. Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice. Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).
- Leon-Rico, D., et al. Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice. LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype. PLoS One. 7 (8), e44219(2012).
- van Rijn, R. S., et al. A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice. Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).
- Wunderlich, M., et al. OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues. Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation? Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
