Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados
En este artículo
Resumen
Resumen
Transporte de proteínas y membranas de la superficie celular hasta el Golgi y más allá es esencial para la homeostasis, la identidad de organelas y la fisiología. Para estudiar el tráfico de proteína retrógrada, recientemente hemos desarrollado herramientas basadas en nanobody versátil para analizar el transporte de la superficie celular para el aparato de Golgi, ya sea por proyección de imagen fija y vivo de la célula, por microscopia electrónica o bioquímico. Hemos diseñado nanobodies funcionalizados anti-verde proteína fluorescente (GFP), carpetas pequeñas, monoméricas, de alta afinidad de la proteína, que puede ser aplicado a líneas celulares de expresión de proteínas de membrana de interés con una parte extracelular de la GFP. Derivatizados nanobodies a los reporteros GFP específicamente se internalizan y transportado piggyback a lo largo de vías de clasificación de los reporteros. Nanobodies fueron funcionalizados con fluoróforos transporte retrógrado por microscopía de fluorescencia y proyección de imagen, con ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) para investigar la localización ultraestructural del reportero nanobody complejos de electrónica en vivo microscopia y con motivos de tirosina sulfatación (TS) para evaluar la cinética de la llegada de trans-Golgi network (TGN). En este artículo metodológico, describiremos el procedimiento general para expresar y purificar nanobodies funcionalizados para bacteriano. Ilustramos el uso poderoso de nuestra herramienta usando los nanobodies mCherry y TS modificado para analizar endocíticas absorción y llegada del TGN de proteínas de carga.
Introducción
Tráfico retrógrado de proteínas y lípidos de la superficie celular en varios compartimientos intracelulares es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana para contrarrestar la secreción y reciclaje de componentes de maquinarias de transporte anterograde1 , 2. después de internalización vía endocytosis clathrin-dependiente - independiente o, carga de proteína y lípidos en primer lugar rellenar temprano endosomas desde donde son más bien a lo largo del sistema endo-lisosomales, reciclado a la membrana plasmática, Redirigido o dirigidas a la red trans-Golgi (TGN). Reciclaje de endosomas y la s....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. bacteriana transformación con Nanobodies funcionalizados
Nota: Este protocolo ha sido optimizado para la expresión, purificación y análisis de nanobodies funcionalizados anti-GFP como se describió anteriormente30. Derivatización con otras moléculas de proteína puede requerir modificación de este protocolo estándar.
- Descongelar las bacterias chemocompetent (~ 100 μL) adecuadas para la expresión de la proteína (p. ej., Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) células) colocándolos en hielo.
Nota: Preparar chemocompetent células bacterianas según procedimientos de la....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para investigar el transporte retrógrado de la proteína a diferentes destinos intracelulares, recientemente hemos establecido una anti-GFP nanobody-herramienta para la etiqueta y siga las proteínas recombinantes de fusión de la superficie de la célula30. Aquí, demostramos la producción bacteriana de tal derivatizada nanobodies y demostrar su aplicación al estudio de absorción endocíticas por microscopía de fluorescencia y immunoblotting, así como su uso para invest.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Nanobodies representan una clase emergente de andamios de proteína ligante con muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales: son pequeños, estables, monoméricas, puede seleccionarse para bonos de alta afinidad y falta disulfuro33,35, 44 , 45. se utilizan en un número de aplicaciones, tales como en sistemas de cultivo de células y organismos en el desarrollo de la biología4.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por Grant 31003A-162643 por la Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Nicole Beuret y el Biozentrum instalación del núcleo de la proyección de imagen (IMCF) para apoyo.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-GFP | Sigma-Aldrich | 118144600001 | producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche |
| Anticuerpo anti-His6 | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| Anticuerpo anti-actina | EMD Millipore | MAB1501 | |
| Cabra anti-conejo HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| Cabra anti-ratón HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | disuelto en 1x PBS/1%BSA |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Applichem | A3672 | |
| D-biotina | Sigma-Aldrich | B4501 | disuelto en ácido estéril 500 mM NaH2PO4 o DMSO |
| 5-aminolevuilnic (dALA) clorhidrato | Sigma-Aldrich | A3785 | disuelto en agua estéril |
| DNasa I | Applichem | A3778 | disuelto en agua estéril |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | 18037059001 | producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromicina | Invivogen | ant-pr-1 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| Applichem | A3704 | ||
| Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Suero fetal de ternero (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| Azufre-35 como sulfato de sodio | Hartmann Analytics | ARS0105 | El producto contiene 5 mCi |
| Sales equilibradas de Earle's | Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM solución de aminoácidos (50x) | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM solución vitamínica (100x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, Mini cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma-Aldrich | 11836153001 | El producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche |
| Isopropil-β-D-tiogalactopiranosida (IPTG) | Applichem | A1008 | disuelto en agua estéril, el stock es de 1 |
| M Sal disódica de carbenicilina | Applichem | A1491 | disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL |
| de sulfato de kanamicina | Applichem | A1493 | disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL |
| Coomassie-R (Azul brillante) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Applichem | A3813 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose de alto rendimiento | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| Sus columnas GraviTrap | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| Su kit de amortiguación | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| Columnas de desalinización PD10 desechables GE | Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Geles Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 pocillos | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) sin Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Platos de 35 mm | Falcon | 353001 | |
| placas de 6 pocillos | TPP | 92406 | |
| Cubreobjetos de vidrio (n.º 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | disuelto en 40% DMSO 60% isopropanol, stock en 500 |
| mM Triptona | Applichem | A1553 | |
| Extracto de levadura | Applichem | A1552 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Merck Millipore | 105833 | disuelto en agua estéril, caldo de 1 M |
| Cloruro de calcio dihidratado | Merck Millipore | 102382 | disuelto en agua estéril, caldo de 1 M |
| Cloruro de sodio | Merck Millipore | 106404 | disuelto en agua estéril, el stock es de 5 M |
Referencias
- Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
- Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-5....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
