Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.
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Artículo de método
Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos
En este artículo
Resumen
Resumen
La ingesta de sal excesiva contribuye a la inflamación y desempeña un papel vital en el desarrollo de la hipertensión arterial. Hemos encontrado que presentadoras de antígeno células dendríticas (DCs) pueden detectar sodio extracelular elevado conduce a la activación de la NADPH oxidasa y la formación de isolevuglandin (IsoLG)-aductos de proteínas. Estas proteínas IsoLG aductos reaccionan con proteínas de uno mismo y promover un estado autoinmune y la hipertensión. Hemos desarrollado y optimizado métodos de vanguardia para estudiar la función de DC en la hipertensión arterial. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento, en vitro tratamiento con sodio elevado y transferencia adoptiva de CD11c esplénicos murinos+ células en ratones receptores para estudiar su papel en la hipertensión arterial.
Introducción
Exceso de sal dietético es un factor de riesgo para la hipertensión. 1 , 2 la Asociación Americana del corazón recomienda un máximo de 2.300 miligramos (mg) de ingesta de sodio (Na+) por día, sin embargo; menos del 10% de la población de Estados Unidos observa esta recomendación. 3 , 4 reducciones moderadas en la ingesta de Na+ bajan la presión arterial y reducen los nuevos casos anuales de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular en los Estados Unidos en un 20%. 5 un gran problema con el consumo ex....
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Protocolo
De la Universidad de Vanderbilt institucional Animal Care y uso Comité han aprobado los procedimientos descritos en este documento. Ratones se ocupa y cuidadas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (prensa de Academias nacionales. Revisado 2010).
1. aislamiento de bazos de ratones
- Preparar el RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 50 μm β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Eutanasia a 10 – 12 semanas-viejos ratones machos C57bl/6 por la inhalación de CO2 . Rocíe el pecho y los lados del ratón con etanol al 70%. En el lado izquierdo, abra con cuidado ....
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Resultados
La figura 1 representa un esquema de los pasos descritos arriba. Bazos de ratón aislados se ordenan para CD11c+ DCs por célula magnética clasificación y plateado en los medios de sal normales (NS; 150 mmol de NaCl) o alta media sal (capítulo; 190 mmol NaCl) para 48 h. CD11c+ DCs se transfieren eventualmente por retro-orbital inyección a los ratones receptores ingenuos. Diez días más tarde, se implantan ratones con osmótico minipumps de d.......
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Discusión
En el protocolo actual, hemos optimizado los procedimientos para aislar CD11c+ DCs de bazos de ratones y eventualmente transferirlos en ingenuos animales para estudiar el papel de la DCs en la hipertensión inducida por la sal. Este protocolo puede ser adaptada para aislar y eventualmente transferir otros subconjuntos de células inmunes como macrófagos, monocitos y células inmunitarias adaptativas incluyendo los linfocitos T y B. Hemos optimizado el proceso de digestión esplénico para lograr la supervivencia de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por American Heart Association otorga POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. y institutos nacionales de salud otorgar K01HL130497 a A.K.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| APC/Cy7 anti-ratón CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Colagenasa D | Roche | 11088866001 | |
| DNasa I | Roche 10104159001 | ||
| DPBS sin calcio y magnesio | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Reactivo bloqueante | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-ratón CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS Tubo C | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dispositivo disociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Protocolo de uso: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD kit de tinción de células muertas violetas fijables | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separador QuadroMACs | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medio | Gibco | 11835-030 |
Referencias
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
- Lev-Ran, A., Porta, M.
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Reimpresiones y permisos
