Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Resumen

La ingesta de sal excesiva contribuye a la inflamación y desempeña un papel vital en el desarrollo de la hipertensión arterial. Hemos encontrado que presentadoras de antígeno células dendríticas (DCs) pueden detectar sodio extracelular elevado conduce a la activación de la NADPH oxidasa y la formación de isolevuglandin (IsoLG)-aductos de proteínas. Estas proteínas IsoLG aductos reaccionan con proteínas de uno mismo y promover un estado autoinmune y la hipertensión. Hemos desarrollado y optimizado métodos de vanguardia para estudiar la función de DC en la hipertensión arterial. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento, en vitro tratamiento con sodio elevado y transferencia adoptiva de CD11c esplénicos murinos⁺ células en ratones receptores para estudiar su papel en la hipertensión arterial.

Introducción

Exceso de sal dietético es un factor de riesgo para la hipertensión. ^{1 , 2} la Asociación Americana del corazón recomienda un máximo de 2.300 miligramos (mg) de ingesta de sodio (Na⁺) por día, sin embargo; menos del 10% de la población de Estados Unidos observa esta recomendación. ^{3 , 4} reducciones moderadas en la ingesta de Na⁺ bajan la presión arterial y reducen los nuevos casos anuales de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular en los Estados Unidos en un 20%. ⁵ un gran problema con el consumo excesivo de sal es que 50% de la población hipertensa presenta sensibilidad a la sal, definida como un aumento de 10 mmHg en la presión arterial tras Na^{Na+ carga o una caída similar en la presión arterial +} la diuresis y restricción. ⁶ sensibilidad a la sal también se produce en el 25% de los individuos normotensos y es un predictor independiente de muerte y eventos cardiovasculares. ^{7 , 8} mecanismos de detección de sal en la hipertensión con el riñón han sido bien estudiados; sin embargo, estudios recientes sugieren que las células inmunes pueden sentir Na⁺. ^{9 , 10}

La evidencia reciente sugiere que cambios en extra renal Na⁺ manipulación pueden causar acumulación de Na⁺ en el intersticio y promover la inflamación. ^{11 , 12} nuestro laboratorio y otros han demostrado que las células del sistema inmunitario tanto innato y adaptativo contribuyen a la exacerbación de la hipertensión arterial. ^{9 , 13 , 14 , 15} varios estímulos de hipertensos, como la angiotensina II, norepinefrina y causa sal macrófagos, monocitos y linfocitos T que infiltran el riñón y vasculatura y promover la retención de Na⁺ , vasoconstricción, hipertensión elevación y daño de órganos. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} en estudios anteriores, encontramos que los DCs acumulan isolevuglandin (IsoLG)-proteína aductos en respuesta a diversos estímulos de hipertensos incluyendo angiotensina II e DOCA sal hipertensión. ¹⁴ IsoLGs son altamente reactivos productos de peroxidación lipídica que rápidamente y covalente aducción a lisinas en proteínas y su acumulación se asocia con la activación de la DC. ¹⁴ recientemente hemos establecido que elevado Na⁺ es un estímulo potente para la proteína IsoLG aducción formación murine DCs.⁹ Na⁺ entrar DCs es mediada por transportadores sensible amilorida. Na⁺ entonces se intercambia para el calcio (Ca^{2 +}) vía el /Ca^{2 +} intercambiador de Na⁺. CA^{2 +} activa la proteína quinasa C (PKC) que activa la NADPH oxidasa lleva a mayor superóxido (O₂^{· -}) y proteína IsoLG aducción formación. ⁹ transferencia adoptiva de hipertensión de primos de DCs sal expuestos en respuesta a una dosis sub-presor de la angiotensina II. ⁹

Identificación de CD11c⁺ DCs de tejidos ha sido previamente limitada a la inmunohistoquímica y RT-PCR y aislamiento de DCs se ha limitado a ordenar por citometría de flujo de la célula. Aunque flujo citometría celular clasificación es un método eficaz para el aislamiento de las células inmunes, es costoso, desperdiciador de tiempo y conduce a una baja producción de células viables. Por lo tanto, nos hemos optimizado un protocolo paso a paso para la digestión de tejido, estimulación in vitro y transferencia adoptiva de CD11c⁺ DCs para el estudio de la hipertensión.

Protocolo

De la Universidad de Vanderbilt institucional Animal Care y uso Comité han aprobado los procedimientos descritos en este documento. Ratones se ocupa y cuidadas según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (prensa de Academias nacionales. Revisado 2010).

1. aislamiento de bazos de ratones

1. Preparar el RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 50 μm β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina.
2. Eutanasia a 10 – 12 semanas-viejos ratones machos C57bl/6 por la inhalación de CO₂ . Rocíe el pecho y los lados del ratón con etanol al 70%. En el lado izquierdo, abra con cuidado la piel y la cavidad peritoneal para exponer el bazo.
3. Utilizando pinzas pequeñas, cuidadosamente mover los intestinos y el hígado en el lado izquierdo del ratón y con unas tijeras finas suavemente suprimir el bazo.
   Nota: Este paso debe hacerse con mucho cuidado como daños en el tracto gastrointestinal pueden provocar contaminación.
4. Coloque cada bazo suprimido en tubo cónico de 15 mL etiquetado que contiene 3 mL de Medio RPMI 1640.

2. generación de suspensiones de la célula de bazo

Nota: El bazo puede disociarse en una suspensión unicelular combinando disociación mecánica y la digestión enzimática.

1. Preparar la solución de digestión de bazo agregando colagenasa D (1 mg/mL; 0,29 U/mg liofilizado) y DNasa (0,1 mg/mL) a preparado Medio RPMI 1640 (ver paso 1.1)
2. Utilizar pinzas para transferir el bazo en un C (disociación tubo) que contiene 3 mL de solución de digestión de bazo.
3. Llevar a cabo la disociación mecánica utilizando un homogeneizador semi-automatizado según las instrucciones del fabricante.
   1. Coloque el tubo de C en el homogenizador semi automatizado, asegurando que el tubo C se coloca firmemente en el brazo giratorio. Una vez que se coloca el tubo C, presione el botón start en el homogenizador semi automatizado para ejecutar el protocolo bazo 04.01 por 60 s.
      Nota: Disociación mecánica también puede realizarse colocando un filtro μm 40 encima de un tubo cónico de 50 mL y pulir suavemente el bazo a través del filtro. Después de moler el bazo, a través de enjuague el filtro de 40 μm con 10 mL de Medio RPMI.
4. Después de la disociación mecánica, separar el tubo de la homogeneizadora y realizar la digestión enzimática. Incubar las muestras durante 15 min a 37 ° C debajo de rotación continua (20 rpm).
5. Transferir la solución pipetear en un tubo cónico de 50 mL después de la filtración a través de un tamiz de 40 μm. Lave el filtro μm 40 con 10 mL de PBS de Dulbecco (dPBS). Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
6. Después de la centrifugación, Aspire completamente el sobrenadante y lavar el pellet a resuspender en 10 mL de dPBS. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.

3. aislamiento de CD11c⁺ DCs de suspensión de célula esplénica

1. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de dPBS y cuente el número de células usando un hemocitómetro y trypan azul exclusión.
2. Sedimenten las células por centrifugación a 300 x g, durante 10 min a 4 ° C.
3. Aspire completamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 400 μL de tampón de (MACs) clasificación de la célula activado magnéticamente.
4. Añada 100 μl de microesferas de CD11c (véase Tabla de materiales) por 1 x 10⁸ células.
5. Vórtice de la suspensión de células e incubar 10 minutos en el refrigerador a 4 ° C.
6. Añadir 10 mL de tampón de MACs para lavar las células. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
7. Aspirar completamente el sobrenadante y resuspender en 500 μl de tampón de MACs.

4. magnética separación de CD11c⁺ DCs

Nota: Separación magnética se realiza manualmente con un separador magnético (véase Tabla de materiales) equipado con LS columnas. Separación magnética puede hacerse también, automáticamente, con un separador magnético automatizado. (véase Tabla de materiales).

1. Colocar la columna de LS en el campo magnético del separador MACs y un tubo cónico de 15 mL en cada columna para recoger el flujo a través.
2. Enjuagar la columna con 3 mL de tampón de LS.
3. Coloque la suspensión celular en cada columna de LS y recoger el flujo a través células sin etiqueta.
4. Lavar la columna con 3 mL de tampón de MACs que recoge las células sin etiqueta que pasan a través de LS. Lavar la columna de LS 2 veces más.
5. Quitar la columna de LS del separador magnético. Añadir 5 mL de tampón de MACs a cada columna y eliminar inmediatamente las células magnéticamente etiquetadas hundiendo firmemente la columna LS en un tubo cónico de 15 mL limpio.
   Nota: Es importante realizar un aislamiento doble de CD11c células para obtener una suspensión de células de alta pureza. Por lo tanto, repita los pasos 3.1 a 4.5. y 4 de la figura de referencia para normas de pureza. Este paso mejora la pureza de CD11c⁺ células 90 – 95%.
6. Determinar CD11c⁺ DC número en un hemocitómetro mediante exclusión del azul tripán. Diluir la muestra de células en una dilución de 1:1 en solución de azul de tripano 0.4%.
   Nota: las células no viables se teñido azules, mientras que las células viables serán siendo sin mancha.
   1. Para ello, cuidadosamente Llene un hemocitómetro con 10 μl de la dilución de la muestra de células e incubar durante 1 minuto.
   2. Contar las células en 4 cuadrados de 1 x 1 mm² en la cámara que ha sido cargada para determinar el número de células viables.

5. en el tratamiento de sal Vitro alta de CD11c⁺ DCs

1. Preparar medio de cultivo DC agregando 10% FBS, 0,1 mM HEPES, piruvato de sodio 1 m m, 50 μm β-mercaptoetanol y 1% de penicilina/estreptomicina 500 ml 1640 RPMI.
2. Preparar 10 x DC medios de cultivo celular sal alta (400 mM) peso 1,17 g de NaCl y colocándola en un tubo falcon de 50 mL estéril. Añadir 50 mL de medios de cultivo celular de DC estéril (preparado en el paso 5.1) al tubo falcon de 50 mL y de vortex hasta el NaCl en solución.
3. Inmediatamente filtrar el alta sal DC los medios de cultivo utilizando filtración de vacío con filtro 0.2 μm en una campana de cultivo celular.
4. Cada suspensión de células desde el bazo a 300 x g durante 10 min a 4 º de la centrífuga. Resuspender cada precipitado de células en medios de cultivo CC a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL.
5. Pipetear 900 μL (aproximadamente 1 x 10⁶ células) de la suspensión de la DC en un fondo plano de 24 pocillos placa Falcon. Añada 100 μl alta sal DC de medios de cultivo para cada pozo hasta una concentración final de sodio de 190 mM. Etiqueta de la placa y lugar a 37 ° C humedecido con incubadora de CO₂ durante 48 h.

6. adoptivo transferencia de sal alta tratados CD11c⁺ DCs

1. Después de la estimulación in vitro durante 48 h, retire la placa de los 37 ° C humedecido con incubadora de CO₂ .
2. Pipetear el célula medios de cultivo y hasta Resuspender el CD11c⁺ DCs. Pipetear el CD11c⁺ CC suspensión en su correspondiente etiquetado tubo de 1,6 mL. Repita este paso para cada individuo bien plateado.
3. Centrifugar cada CD11c⁺ CC suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de DC con 100 μl de dPBS estéril.
4. Sorteo CC suspensión en una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 27 G 1/2 pulgada.
5. Coloque el ingenuo macho 10 semanas de edad C57bl/6 ratones debajo del 2% isoflurano para lograr un plano quirúrgico estable. Compruebe el nivel de anestesia con la falta del reflejo pedal. Una vez que se consigue un plano quirúrgico estable, lentamente y con cuidado introducir la aguja en el espacio retro-orbital en un ángulo de aproximadamente 30°.
   Nota: El bisel de la aguja de 27 G debe señalar hacia abajo, lejos de los ojos, para evitar daños oculares.
6. Lenta y suavemente inyectar el CD11c⁺ CC suspensión (aproximadamente 1 x 10⁶ células). Una vez completada la inyección, retire con cuidado la aguja por el espacio retro-orbital ser conscientes para no dañar el ojo.
   Nota: Después de la inyección, debe haber poco o ningún sangrado. Transferencia adoptiva de CD11c⁺ DCs puede realizarse también utilizando un método de I.V. de la inyección (p. ej. vena de la cola). Los ratones de control reciben CD11c⁺ DCs que fueron cultivadas en medios de sal normales.
7. Retire el cono de nariz de los ratones y monitorearlos durante aproximadamente 30 minutos durante la recuperación de la anestesia.

7. preparación de 14 días dosis bajas angiotensina II (140 ng/kg/min)

1. Preparar el buffer de angiotensina II mediante la adición de 500 μL de NaCl 5 de M y 300 μL de ácido acético. Quantum Satis (QS) hasta 30 mL de desionizada H₂0.
2. Disolver la angiotensina II en solución 5 mg/mL con tampón de angiotensina II. Diluir la solución madre de angiotensina II con buffer adicional para lograr una concentración final que la osmótica minipump entregará angiotensina II en una tasa de 140 ng/kg/min según el peso de cada ratón.
   Nota: Esencial de angiotensina II (mg) = (peso (g) del ratón x 0,2 mg / día x 14 días) / 1.000
   Preparado de angiotensina II (mg) = (esencial angiotensina II x 260 μL) / bomba (0.25 μL/hora)
   Angiotensina II Stock volumen (μL) = preparado angiotensina II / concentración (5 mg/mL) x 1,000 madre
   Diluir el volumen (μL) = 270 - volumen bolsa de angiotensina II
3. Añadir volumen acción de angiotensina II para el diluido (tampón de angiotensina II) basado en los volúmenes calculados en el paso 7.2.
4. Bajo una campana de cultivo celular estéril, abrir minipump osmótico.
5. Añadir solución de diluido de la angiotensina II y expulsar todo el aire de la jeringa y la aguja. Inserte la aguja suministrada en la parte inferior de la minipump osmótico e inyecte lentamente solución de angiotensina II mientras lentamente y con cuidado retrae la aguja de la vejiga.
6. Inserte la cabeza minipump osmótica dentro de la vejiga osmótica, prestando atención a entrar aire en la vejiga.

8. implantación de 14 días dosis bajas angiotensina II Minipumps osmótico

1. Diez días después de la transferencia adoptiva de CD11c⁺ DCs, lugar de ratones en una cámara de isoflurano iniciar anestesia y ratones al cono de la nariz continuamente recibir 2% isoflurano para alcanzar y mantener un plano quirúrgico adecuado.
2. Quitar la piel a lo largo de la parte dorsal del cuello con cortauñas para preparar el sitio quirúrgico. Limpiar la zona depilada con etanol al 70% seguido de betadine 7,5% antes del inicio de la cirugía.
3. Crear una pequeña incisión (de aproximadamente 1,5 cm) en la piel. Introduzca pinzas hemostáticas en la incisión para crear un bolsillo subcutáneo para la colocación de la minipump osmótico.
4. Inserte el minipump en el bolsillo subcutáneo. Cierre la piel herida con 2-3 grapas quirúrgicas y otra aplicación de betadine 7,5% se aplica a la herida y grapas para prevenir la infección.
5. Controlar los ratones durante 30-60 minutos durante la recuperación de la anestesia antes de devolverlos a sus jaulas.
   Nota: Ratones tienen que supervisar hasta 3 – 4 días después de la implantación de la minipump osmótico.

9. aislamiento de bazos de ratones receptores para análisis cytometric del flujo

1. Después de 14 días de la infusión de dosis bajas de angiotensina II, aislar los bazos de ratones recibiendo sal alta en vitro tratan DCs por transferencia adoptiva. Siga los pasos precisos indicados anteriormente (pasos 1 y 2).

10. tinción superficial

1. Transferencia de esplenocitos que se resuspendió en 1 x PBS en poliestireno tubo FACS y centrifugar a 350 x g por 8 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante después de centrifugación. Lavar dos veces con 1 mL de tampón de MACs y centrifugación (350 x g, 8 min, 4 ° C).
   1. Dividir los esplenocitos igualmente tubos de poliestireno diferentes FACS basados en el número de paneles de citometría de flujo deseado.
2. Para realizar la tinción de viabilidad celular de vivos o muertos, se lavan las células con 1 x PBS y centrífuga de (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspender en 1 mL de PBS 1 x y añadir 1 μl de una viabilidad celular (véase tabla de materiales) de la mancha. Incubar por 15 min a 4 ° C (refrigerador o en hielo) cubierto de papel de aluminio para proteger de la luz.
3. Durante la incubación de la tinción de viabilidad celular, preparar el cóctel de anticuerpos para la superficie de la célula tinción en un volumen apropiado de búfer de MACS.
4. Lavar las células con 1 mL de tampón de MACS, centrífuga de (350 x g, 8 min, 4 ° C) y resuspender cada precipitado de células con 100 μl del anticuerpo cóctel. Incubar protegido de la luz durante 30 min a 4 ° C.
   Nota: Cada anticuerpo de citometría de flujo es única, y es muy útil y se recomienda para determinar la cantidad óptima de anticuerpo necesitada realizando una curva de titulación de la dosis para cada anticuerpo específico.
5. Lavan las células dos veces con 1 mL de tampón de MACS y resuspender los esplenocitos en una cantidad apropiada de búfer de MACS por análisis cytometric del flujo.

Resultados

La figura 1 representa un esquema de los pasos descritos arriba. Bazos de ratón aislados se ordenan para CD11c⁺ DCs por célula magnética clasificación y plateado en los medios de sal normales (NS; 150 mmol de NaCl) o alta media sal (capítulo; 190 mmol NaCl) para 48 h. CD11c⁺ DCs se transfieren eventualmente por retro-orbital inyección a los ratones receptores ingenuos. Diez días más tarde, se implantan ratones con osmótico minipumps de d...

Discusión

En el protocolo actual, hemos optimizado los procedimientos para aislar CD11c⁺ DCs de bazos de ratones y eventualmente transferirlos en ingenuos animales para estudiar el papel de la DCs en la hipertensión inducida por la sal. Este protocolo puede ser adaptada para aislar y eventualmente transferir otros subconjuntos de células inmunes como macrófagos, monocitos y células inmunitarias adaptativas incluyendo los linfocitos T y B. Hemos optimizado el proceso de digestión esplénico para lograr la supervivencia de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
APC/Cy7 anti-ratón CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Colagenasa D	Roche	11088866001
DNasa I	Roche 10104159001
DPBS sin calcio y magnesio	Corning	21-031-CV
FcR Reactivo bloqueante	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-ratón CD45	Biolegend	103108
GentleMACS Tubo C	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dispositivo disociador	Miltenyi Biotec	130-093-235	Protocolo de uso: Spleen 04.01
LIVE/DEAD kit de tinción de células muertas violetas fijables	Invitrogen	L34964
LS Columnas	Miltenyi Biotec	130-042-401
Separador QuadroMACs	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medio	Gibco	11835-030