Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.
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Artículo de método
Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido
En este artículo
Resumen
Resumen
Intersticiales y circulantes unida a la membrana extracelulares vesículas pequeñas (EVs) representan un objetivo prometedor para el desarrollo de ensayos de nuevos biomarcadores diagnóstico o pronóstico y probablemente servir como actores importantes en la progresión de un vasto espectro de enfermedades. La investigación actual se centra en la caracterización de las vesículas segregadas de múltiples células y tipos de tejidos con el fin de mejor comprender el papel de EVs en la patogenia de condiciones incluyendo neurodegeneración, inflamación y cáncer. Sin embargo, globalmente consistente y reproducibles técnicas para aislar y purificar las vesículas permanecen en progreso. Por otra parte, apenas se describen los métodos de extracción de EVs de tejidos sólidos ex vivo . Presentamos un protocolo detallado para extraer pequeños EVs de interés de tejidos entero frescos o congelados, incluyendo a muestras de cerebro y tumor, para mayor caracterización. Demostramos la capacidad de adaptación de este método para múltiples análisis aguas abajo, incluyendo microscopía electrónica y caracterización de immunophenotypic de vesículas, así como cuantitativo spectrometry total de proteínas de EV.
Introducción
Pequeñas vesículas extracelulares (EVs) incluyen exosomas derivados de endosomal y microvesículas de membrana-arrojan pequeñas que son de amplio interés biomédico. EVs pequeño están compuestos por una heterogénea población de vesículas de membrana-limite 50-250 nm que contiene las proteínas biológicamente activas, lípidos y ácidos nucleicos que colectivamente se cree que desempeñan un papel importante en multitud de procesos de la enfermedad. Avance de la investigación ha implicado especialmente estas vesículas en neurodegenerativas y trastornos del prión, procesos infecciosos, condiciones autoinmunes o inflamatorias y el crecimiento del tumor y metástasis
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Protocolo
Cerebro entero se obtuvieron con la aprobación del uso Animal institucional y Comité de cuidado (IACUC) de la Universidad Estatal de Florida. Un total de doce cerebros de ratón (3 cerebros de cada grupo de edad: 2, 4, 6 y 8 meses) de un J C57BL/6 fondo fueron utilizados para la extracción de EV, como se describió anteriormente16. Especímenes de tumor de pulmón fueron generosamente donados por Dr. Mandip Sachdeva bajo aprobación de Florida agrícola y mecánica de la Universidad de IACUC. Tumores pulmonares se derivan de la línea celular de adenocarcinoma humano H1975 en ratones nude de inmunodeficientes Balb/c nu/nu. Datos de dos repeticiones de ....
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Resultados
Un Resumen esquemático de la disociación del tejido, centrifugación diferencial y gradiente purificación de vesículas se muestra en la figura 1. La confirmación morfológica e immunophenotypic de EVs purificada de gradiente se destaca en la figura 2. Muestra un diagrama de densidades reproducibles después de ultracentrifugación de la gradiente de iodixanol 10-30%, con dos poblaciones distintas vesículas migran hacia arriba a fracc.......
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Discusión
Interés tanto científico se ha generado con respecto a los roles que EVS pequeño jugar en el microambiente del tumor, así como en función, maduración y desarrollo del órgano. En general, este estudio proporciona un flujo de trabajo optimizado para la extracción de EVs intactos de todo el cerebro o las muestras de tumor. Mientras que aquí simplemente se demuestra la aplicabilidad de esta técnica a pulmón tumor derivado de EVs, este método podría ser adaptado para el trabajo en otros tejidos sólidos, proporcionando oportun.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el Dr. Richard Nowakowski y Florida estado Universidad laboratorio de los recursos para proveer y cuidar de los animales utilizados para desarrollar este protocolo, respetuosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh y la Florida Universidad traslacional ciencia Laboratorio Estatal de asistencia con el trabajo de espectrometría de masas utilizado para la caracterización de aguas abajo de la vesícula, así como la posibilidad de recurso de la proyección de imagen de ciencia biológico CEI de el uso del microscopio electrónico de transmisión en este estudio. Finalmente, agradecemos a Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) para la donació....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 y micro; filtro m | VWR | 28145-505 | |
| Tubos ultracentrífugos de 12 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| tubos de ultracentrífuga de 5,5 mL | Beckman Coulter | 344057 | |
| anticuerpo anti-Alix | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anticuerpo anti-Calnexin | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anticuerpo anti-CD63 | Abcam | ab59479 | |
| anticuerpo anti-CD81 | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anticuerpo anti-Flotillina 2 | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 anticuerpo | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Sintenina-1 | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anticuerpo anti-TSG101 | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ kit de cuantificación de proteínas | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Microscopio electrónico Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 | Microscopía | ||
| cabra anti-conejo IgG (fragmento Fab) | Genetex | 27171 | |
| Inhibidor de la fosfatasa HALT (solución 100x) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| Inhibidor de la proteasa HALT (solución 100x) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernación E medio | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 rotor de cubeta oscilante | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Ultracentrífuga de sobremesa | Ultracentrífuga Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% de yodixanol en solución de agua estéril |
| Q Exactive HF Espectrómetro de masas | ThermoFisher Scientific | ||
| conejo anticabra IgG | Genetex | 26741 | |
| conejo antiratón IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractómetro) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 | rotor Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti cuchara oscilante Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Centrífuga de sobremesa 5804R | Eppendorf | 22623508 |
Referencias
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.
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Reimpresiones y permisos
