Artículo de método

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

DOI:

10.3791/59153

⸱

15 de mayo de 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

En este artículo

Resumen

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El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.

Resumen

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La naturaleza multitrófica de los estudios de expresión génica de herbívoros de insectos exige un gran número de réplicas biológicas, creando la necesidad de protocolos herbáricos más simples y simplificados. Las perturbaciones de los insectos masticadores generalmente se estudian en sistemas vegetales enteros. Si bien esta estrategia de todo el organismo es popular, no es necesario si observaciones similares se pueden replicar en una sola hoja separada. La suposición es que los elementos básicos necesarios para la transducción de la señal están presentes dentro de la propia hoja. En el caso de los primeros acontecimientos en la transducción de la señal, las células sólo necesitan recibir la señal de la perturbación y transmitir esa señal a las células vecinas que se ensayan para la expresión génica.

El método propuesto simplemente cambia el momento del desprendimiento. En experimentos con plantas enteras, las larvas se limitan a una sola hoja que finalmente se separa de la planta y se ensaya para la expresión génica. Si se invierte el orden de la escisión, desde el último en estudios de plantas enteras, hasta el primero en el estudio separado, se simplifica el experimento de alimentación.

Kennebec se propaga por transferencia nodal en un medio de cultivo de tejido simple y se transfiere al suelo para un mayor crecimiento si se desea. Las hojas se extircan de la planta madre y se trasladan a los platos de Petri donde el ensayo de alimentación se lleva a cabo con las etapas larvales de M. sexta. El tejido de la hoja dañado se ensaya para la expresión de eventos relativamente tempranos en la transducción de la señal. El análisis de la expresión génica identificó factores de transcripción Cys2-His2 (C2H2) específicos de la infestación, lo que confirma el éxito del uso de hojas desasociadas en estudios de respuesta temprana. El método es más fácil de realizar que las infestaciones de plantas enteras y utiliza menos espacio.

Introducción

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Herbivory pone en marcha una serie de eventos moleculares durante los cuales una planta puede identificar el ataque y montar una respuesta apropiada para su supervivencia. Una planta recibe dos señales básicas de los insectos masticadores; uno por el daño físico al tejido y el otro a partir de sustancias específicas de insectos. Los patrones moleculares asociados al daño (DamP) se liberan en respuesta al daño creado por las partes bucales larvales y desencadenan una respuesta de herida bien definida que resulta en un aumento de la hormona ácido jasmónico y la transcripción de los genes de defensa1. Uno de los DamPs más conocidos es systemin, un polipéptido que se forma por el escote de la proteína prosystemin más grande después de que una hoja es herida2,3. La respuesta de la herida de ácido jasmónico se modula aún más por patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMPs), que pueden derivarse de saliva de oruga, contenido intestinal (regurgitante) y heces (frass)4. Los insectos utilizan estas sustancias para aumentar o evadir la respuesta de defensa5. Los factores de transcripción transmiten el mensaje de las señales hormonales en la respuesta de defensa a través de la regulación de los genes de defensa aguas abajo6,7,8.

Algunos estudios de interacción entre plantas y insectos utilizados en entornos de laboratorio son del tipo simulado, con el objetivo de aproximar el método natural de alimentación por el insecto. El herbívoro simulado generalmente se logra mediante la creación de daño artificial a los tejidos vegetales con varias herramientas que imitan el mecanismo específico de las partes bucales de insectos suficientes para causar la liberación de DAPP y desencadenar la producción de genes de defensa. Otros componentes específicos de insectos como las secreciones orales o regurgitante a menudo se añaden para replicar la contribución de los HAMPs9,10,11. La creación de un tamaño y tipo específico de herida y la aplicación de cantidades precisas de HAMPs es una ventaja para este tipo de estudios y puede ofrecer resultados más reproducibles. Los estudios herbívoros naturales, donde el daño al tejido vegetal se logra mediante la aplicación de insectos adquiridos en el campo o criados en laboratorio, a menudo son más difíciles porque el tamaño de la herida y las cantidades de HAMP se rigen por el comportamiento de los insectos y añaden variabilidad a la Datos. Los métodos naturales versus simulados y sus ventajas y desventajas están bien debatidas en la literatura12,13,14.

Para estudiar los primeros eventos de señalización, como los factores de transcripción, se debe consumir un cierto porcentaje de la hoja en un período relativamente corto de tiempo, por lo que las larvas deben comenzar a masticar inmediatamente y mantener el consumo hasta que la hoja se congele para su análisis. M. sexta es un alimentador voraz en múltiples plantas solanaceous durante muchas de sus etapas larvales, por lo que es ideal para impartir el máximo daño en un período relativamente corto de tiempo15. Esto es conveniente cuando se estudian los primeros eventos de señalización, ya que la respuesta de la planta ocurre casi inmediatamente después de que un insecto entra en contacto con la superficie de la hoja16,17. El método de contención de jaulas de clip comúnmente utilizado resulta torpe, ya que varias jaulas requerirían ajustes continuos a lo largo del experimento para permitir la eliminación o adición de larvas. Las hojas también deben ser lo suficientemente grandes y fuertes como para soportar la alimentación de múltiples insectos al mismo tiempo. Estos tipos de plantas de patata requieren una gran cantidad de espacio para observar la alimentación. Las larvas a menudo se reubican en la parte inferior de la superficie de la hoja, lo que también hace que las observaciones de alimentación sean bastante difíciles. El uso de plantas enteras para realizar estos experimentos es claramente engorroso.

El estudio actual utiliza hojas desprendidas aisladas en platos Petri en lugar de plantas enteras para agilizar y simplificar todo el enfoque vegetal para estudiar el herbívoro. La aplicación del protocolo en este estudio se limita a la observación de un grupo de factores de transcripción C2H2 inducidos temprano en las hojas de patata después del daño herbívoro por M. sexta larvas.

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Protocolo

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NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para que una persona configure, haga observaciones y recoja muestras. Se pueden combinar varias ejecuciones de la misma configuración para aumentar la replicación biológica. Cualquier repetición adicional del experimento debe configurarse a la misma hora del día para eliminar posibles influencias diurnas en la expresión génica. El protocolo está diseñado para crear 3 hojas 'infestadas' para 5 puntos de tiempo de cosecha separados. Las hojas de control coincidentes para cada punto de tiempo crean un total de 30 muestras. El experimento se puede realizar con una variedad de tamaños de hojas y etapas larvales, pero se recomienda que el tamaño de la hoja, la etapa larval y el tiempo de infestación sean consistentes durante todo el procedimiento.

1. Preparación de las plantas de patata

NOTA: Todos los pasos que requieren técnica estéril deben realizarse en una campana de cultivo de tejido18,19.

  1. Prepare las plantas de Kennebec de la fuente explantada.
    1. Prepare el medio de propagación.
      1. Añadir 4,43 g de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas en polvo, 20 g de sacarosa y 2 g de sustituto de agar a 1 L de agua purificada con ósmosis inversa (RO) en un matraz de 2 L con barra de espín. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando NaOH mientras continúa revolviendo.
        NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave.
      2. Añadir 1 ml de conservante/biocida y autoclave en ciclo líquido durante 20 min (121oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de medio de propagación estéril y refrigerado a recipientes de cultivo estériles (por ejemplo, Magenta o Plantcon) utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.
    2. Preparar el material de la explantación.
      1. Obtener fuente explantar como papas de semilla kennebec y eliminar todos los restos de tierra mediante el lavado con grifo H2O. Retire los brotes y cortar en trozos de 2 cm con un bisturí estéril.
      2. Esterilice las piezas del brote empapando durante 15 s en 70% de etanol, seguido de 13 min en 1:1 lejía (1 parte de RO-agua: 1 parte de lejía germicida/comercial concentrada). Enjuague 5 veces en H2O estéril.
      3. Transfiera el material explantativo a recipientes de cultivo de tejido estéril con medio de propagación en una campana de cultivo de tejido utilizando una técnica estéril. Transfiera los recipientes a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 a 2o123 semanas o hasta que se formen plantlets a 24oC, 16 h de luz (140 m-2os-1)/8 h fotoperiodo oscuro.
  2. Preparar plantas de papa sin tejido sintraidos.
    1. Prepare el medio de transferencia nodal.
      NOTA: Esto hará 10 vasos de cultivo de tejido que pueden ser utilizados el mismo día o pueden ser hechos con anticipación y almacenados a 4 oC hasta la transferencia nodal.
      1. Añadir 36,43 g de mezcla de agar nutritivo a 1 L de agua purificada por RO en un matraz de 2 L con una barra de centrifugado. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando KOH mientras continúa agitando.
        NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave.
      2. Autoclave en ciclo de líquido durante 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de recipientes de cultivo nodal refrigerados estériles a recipientes de cultivo estériles (ver la Tabla de Materiales)utilizando técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.
    2. Prepara esquejes nodal.
      1. Obtener los plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado (producido en el paso 1.1.2). Las plantlets deben tener al menos de 3 a 4 nodos (puntos de bifurcación). Retire las hojas con tijeras estériles o bisturí. Cortar las ramas cerca del tallo principal, dejando alrededor de 2 mm de tejido de rama.
      2. Retire las secciones nodal del tallo cortando aproximadamente 2 mm por encima y por debajo de cada punto de rama o nodo. Organizar esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga medio de transferencia nodal (producido en el paso 1.2.1.2) en la misma orientación que en el recipiente anterior (rama apuntando hacia arriba).
      3. Transfiera los recipientes con esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 u20123 semanas a 24 oC, 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro.
        NOTA: Cada corte nodal crecerá hasta convertirse en una nueva planta. El número de esquejes en cada recipiente determina el tamaño de la hoja. Menos esquejes transferidos por recipiente darán lugar a hojas más grandes. Tres plantas por recipiente tendrán hojas de 15 mm x 20 mm en 2 u20123 semanas.
  3. (Opcional) Preparar plantas de patata Kennebec cultivadas en el suelo.
    NOTA: Para producir hojas más grandes, las plantas de papa sin extensión de nodal se pueden transferir al suelo.
    1. Transfiera las plantas de patata cultivadas en el medio de transferencia nodal medio a tierra tirando suavemente de la planta del medio hasta que todo el tejido radicular se libere del agar.
    2. Transfiera al suelo justo por encima del 1o nodo de las raíces y empaque ligeramente el suelo alrededor del trasplante. Sube suavemente para asegurar el contacto del suelo con el sistema radicular.
    3. Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y temperaturas diurnas/nocturnas de 25/20 oC.
      NOTA: Las plantas están listas cuando las dos hojas completamente expandidas han alcanzado el tamaño adecuado para el ensayo.
  4. (Opcional) Preparar plantas de patata cultivadas con tubérculos.
    NOTA: Las plantas de patata cultivadas a partir de tubérculos son más grandes y robustas y pueden ser útiles si se crían larvas en las plantas o si se desea alimentar la larvadurante durante la noche.
    1. Coloque un tubérculo de patata 6 en profundidad en una olla de 10 en maceta que contenga mezcla de suelo complementada con fertilizante de liberación lenta de 10 ml de pellets.
    2. Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y 25/20 oC de temperatura diurna/noche. Las plantas están listas aproximadamente a 30 o201240 días desde la plantación del tubérculo.
      NOTA: No utilice plantas que hayan comenzado a florecer.

2. Preparación de insectos para la alimentación

  1. Obtener la etapa larval deseada de M. sexta.
    NOTA: Las larvas para este estudio fueron criadas en dieta artificial hasta la 5a estrella20 y escenificadas por un individuo experimentado del insectiario interno. Las larvas también pueden criarse parcial o completamente en el tejido vegetal. Las larvas no comen inmediatamente antes de una muda y son más propensas a comer justo después de la muda, por lo que la puesta en escena adecuada es importante21.
  2. Transfiera las larvas a un recipiente de contención apropiado (por ejemplo, plato de cultivo de tejido de 6, 12, 24 pozos) dependiendo del tamaño de la larva. Debe haber una larva por pozo en el plato.
    NOTA: Las larvas pueden mostrar un comportamiento territorial o caníbal sin una fuente de alimento y pueden lesionarse si se alojan juntas.
  3. (Opcional) Las larvas de hambre durante hasta 2 h, ya que esto puede mejorar la alimentación larvaria.
    NOTA: Las larvas deben estar en un recipiente de contención almacenado en la cámara de crecimiento durante este tiempo.

3. Configuración de componentes para el experimento de infestación

NOTA: Consulte el resumen esquemático de la Figura1.

  1. Cree plantillas de ubicación para cada punto de tiempo de cosecha.
    NOTA: Es útil configurar 5 bandejas diferentes para cada punto de tiempo de cosecha. Esto mantiene las muestras organizadas y permite que los platos se muevan de manera más eficiente como un conjunto sin cambiar su disposición. Si se realizan cálculos porcentuales de daño, esto es esencial, ya que las imágenes anteriores y posteriores a la infestación deben capturarse a la misma distancia focal.
    1. Obtenga 5 bandejas robustas capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado y línea con papel blanco.
      NOTA: El tamaño de la placa Petri se basa en el tamaño de hoja elegido para el ensayo de alimentación. La hoja debe caber fácilmente en el plato sin tocar los lados. Por ejemplo, un plato de 60 mm x 15 mm es adecuado para hojas de hasta 50 mm de longitud o anchura.
    2. Trace un conjunto de seis círculos usando la placa Petri de tamaño adecuado en el papel en cada bandeja. Etiquete un conjunto de círculos 'control' A, B y C y el otro 'infestado' A, B y C. También etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.
  2. (Opcional) Configure una cámara para la captura de imágenes "antes de la infestación" y "después de la infestación".
    1. Asegure una cámara en un soporte en la distancia focal adecuada para la captura de imágenes de todos los platos Petri en la plantilla de colocación.
  3. Etiquetar los tubos de punto de tiempo de cosecha.
    1. Etiquete un conjunto de tubos de microcentrífuga de 30, 1,7 ml correspondientes a cada círculo en la plantilla de colocación. Etiquetar los tubos para identificar adecuadamente la perturbación (control/infestado), la carta de replicación de la planta (A, B o C) y el punto de tiempo de cosecha (número de minutos después del período de infestación).
  4. Prepare los platos de Petri elegidos en el paso 3.1.1.
    1. Coloque un disco de papel de filtro estéril en cada uno de los 30 platos Petri del paso 3.1.1. Añadir agua estéril para humedecer los discos; no permita que el exceso de agua se acuse en el plato. Coloque cada plato en cada uno de los seis círculos en cada plantilla de colocación.
    2. Coloque tres plantas de papa junto a cada plantilla de colocación. Asegúrese de que las plantas tienen la misma edad y tamaño relativo.

4. Realizar infestación

NOTA: Se configura una plantilla de punto de tiempo de cosecha/ubicación a la vez.

  1. Retire las dos hojas superiores emparejadas de cada planta con tijeras estériles y coloque una hoja en la placa Petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta (A, B y C). Lleve a cabo este proceso lo más rápido posible.
  2. (Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar una imagen de "antes de la infestación".
  3. Transfiera las larvas a cada plato infestado usando fórceps suaves al tacto tan rápido como sea posible. Ajuste el temporizador para el tiempo de 'infestación' deseado.
    NOTA: El período de tiempo en que las larvas consumen el tejido de la hoja es el "tiempo de infestación". Esto es algo que se puede determinar empíricamente usando unas pocas hojas de prueba / larvas antes del inicio de la infestación real. El "tiempo de infestación" elegido debe ser consistente para todas las hojas infestadas.
    NOTA: Las larvas deben ser manipuladas con cuidado por fórceps suaves. De 2a a 4a instar puede ser agarrado suavemente por su cuerno o sección media.
  4. Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas estén comiendo. Las larvas deben añadirse/eliminarse en función del comportamiento de alimentación. Mantenga las tapas de los platos de Petri tanto como sea posible.
    NOTA: Se pueden utilizar varias larvas por hoja.
  5. Retire las larvas de las hojas al final del tiempo de infestación. Inicie el temporizador para el tiempo de cosecha.
  6. (Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar la imagen "después de la infestación".
    NOTA: Las seis hojas en la plantilla de colocación se cosechan en el momento específico de la cosecha.

5. Cosecha de hojas

  1. Transfiera cada hoja al tubo etiquetado correspondiente al final de cada punto de tiempode cosecha y congele inmediatamente dejando caer el tubo en el líquido N 2. Almacenar el tejido vegetal cosechado a -80 oC hasta el aislamiento del ARN.
  2. Repita los pasos 4-u20125.1 para cada punto de tiempo de cosecha.

6. Procesamiento del tejido de la hoja para el análisis de la expresión génica

  1. Moler el tejido de la hoja congelada en un polvo con un micropsto.
  2. Aísle el ARN total y el proceso de expresión génica como se describió anteriormente22.

7. (Opcional) Estimación del daño de las hojas

  1. Calcule visualmente el porcentaje del daño de la hoja o calcule el área de la hoja en las imágenes antes y después de la infestación.
  2. Mida el área de la hoja con herramientas de software (por ejemplo, Fenofita)23.
  3. A partir de las mediciones del área de la hoja, calcule el porcentaje de daño como
    % de daño [(área de la hoja antes – área de la hoja después)/área de la hoja antes] x 100.

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Resultados

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El consumo de hoja define el éxito del protocolo. Las larvas sanas y escenificadas con precisión deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante el tiempo de infestación. En el video1, la larva en la parte superior comienza a masticar inmediatamente después de la colocación y mantiene una velocidad constante durante la alimentación. Esto es especialment...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de metodologías herbáceas de plantas enteras existentes no es necesario para lograr el objetivo de este estudio en particular (es decir, examinar un conjunto de genes candidatos para su respuesta a la infestación). El beneficio obvio del refinamiento de la hoja separada es acortar el tiempo que se tarda en realizar ensayos herbívoros. La naturaleza difícil de controlar de plantas enteras con jaulas de clip se elimina y los ensayos se realizan antes, ya que las plantas de tan solo 2 semanas se pueden utilizar para ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores quieren agradecer a Bob Farrar y Alexis Park por proporcionar insectos utilizados en este estudio y por su experiencia en la puesta en escena larval. Gracias adicionales a Michael Blackburn y Saikat Ghosh por la revisión crítica del manuscrito.

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.

USDA es un Proveedor y Empleador de Igualdad de Oportunidades.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
sustituto de agarLaboratorios de FitotecnologíaG3251el producto es
un recipiente de contención Gelzan (plato de 6, 12 o 24 pocillos)Fisher Scientific 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51muchas otras empresas venden estos productos
huevos de manduca Compañía de Suministros Biológicos de Carolina14388030-50 huevos
huevos de manduca Gusano de los Grandes LagosNA50, 100, 250 o 500 huevos
larvas de manducaCarolina Biological Supply Companyllama para estadios larvales específicos solicitacualquier
estadio larvas de manducagusano de los Grandes Lagosllama para estadios específicos solicitudes de
microcentrífugas de estadio, 1.7 ml Thomas Scientific1158R22estos han sido probados en N2 líquido y no explotarán
Murashige & Medio basal de Skoog (MS) con vitaminasPhytoTechnology LaboratoriesM519utilizado para hacer la mezcla de agar de nutrientes del medio de propagación
PhytoTechnology LaboratoriesM5825el producto es Murashige & Medio basal Skoog con vitaminas, sacarosa y
discos de filtro de papelFisher Scientific 09-805ACírculos Whatman-comprar para encajar en
Petri placa de Petri, 60X15 mm o 100X15 mmFisher Scientific FB0875713A o FB0875712tamaño de compra apropiado para el tamaño
la hoja tubérculos de papa cualquiertamaño B (no orgánico)sugiere Maine Farmer' s Macetas de intercambio
, 10" Suministros de invernadero Griffin, Inc.41PT1000CN2
conservante/biocidaTecnología de células vegetalesEl producto NAes PPM (mezcla de conservantes vegetales)
patatas de siembra para la fuente de explantede cualquiertamaño B (no orgánico)sugiere Maine Farmer' s Intercambio
fertilizante de liberación lenta (14-14-14 )cualquierNAOsmocote es una marca popular
pinzas de tacto suaveBioQuip4750
mezcla de sueloGriffin Greenhouse Supplies, Inc.65-51121el producto es el recipiente de cultivo estéril de mezcla Sunshine LC1
 Laboratorios de FitotecnologíaC2100Recipiente tipo magenta,
recipiente de cultivo estéril PTL-100 Fisher Scientific ICN2672206producto es MP Biomedicals Plantcon
Gelzan placa de de de

Referencias

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