Artículo de método

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

12K vistas

⸱

DOI:

10.3791/59156

⸱

19 de marzo de 2019

 ,  , 
1Electron Microscopy Core Unit, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Resumen

La técnica de preparación de muestra descrito está diseñada para combinar la mejor calidad de preservación ultraestructural con el contraste más adecuado para la modalidad de proyección de imagen en un ion enfocado viga microscopio electrónico de barrido (FIB-SEM), que se utiliza para obtener pilas de imágenes secuenciales para la reconstrucción 3D y modelado. Alta presión (HPF) de congelación permite cerca de preservación estructural nativa, pero la posterior congelación de sustitución a menudo no proporcionan suficiente contraste, especialmente para un espécimen más grande, que es necesario para la proyección de imagen de alta calidad en el SEM para 3D reconstrucción. Por lo tanto, en este protocolo, después de la sustitución de congelación, medidas de contraste adicionales se llevan a cabo a temperatura ambiente. Aunque estos pasos se realizan en el microondas, también es posible seguir el proceso de banco tradicional, que requiere tiempos de incubación más largos. La incorporación posterior de cantidades mínimas de resina permite la más rápida y más precisa orientación y preparación dentro de la FIB-SEM. Este protocolo es especialmente útil para muestras que requieren de una preparación por congelación de alta presión para una preservación ultraestructural confiable pero no obtener suficiente contraste durante la sustitución de congelación para la proyección de imagen de volumen mediante FIB-SEM. En combinación con la incrustación de resina mínima, este protocolo proporciona un flujo de trabajo eficiente para la adquisición de datos de volumen de alta calidad.

Introducción

Congelación de alta presión es el método de preparación de muestra de elección para la obtención de alta calidad ultraestructural preservación, que representa el estado nativo de una muestra mucho mejor que los métodos convencionales de preparación mediante fijación química1. Este método de cryo-preparación es útil para las muestras como un requisito estricto para el uso del organismo modelo elegans de Caenorhabditis3mouse myelinated tejido2 . Después de la sustitución de congelación e incrustación de resina, estas muestras generalmente son analizadas por microscopia electrónica de transmisión (TEM) o la tomografía electrónica (ET). Si volúmenes más grandes deben ser reflejados mediante FIB-SEM o la proyección de imagen serial de cara de bloque para alta resolución reconstrucciones 3D a gran escala, en nuestra experiencia adecuada proyección de imagen por SEM es a menudo obstaculizada por la falta de contraste. En el FIB-SEM, la imagen generalmente se registra por la detección de backscattered electrones desde el haz de electrones primario. El rendimiento de backscattered electrones es proporcional al contenido de metales pesados en la muestra. Por lo tanto, protocolos fueron especialmente diseñados para imágenes para realzar el contraste de volumen de impregnación del metal pesado adicional. Tales métodos se basan en muestras fijadas químicamente y aplicarán una combinación de tetróxido de osmio-thiocarbohydrazide-osmio tetróxido4, según lo descrito por Knott et al5, para la serie de cara de bloque y centrado de la viga de ion, microscopía electrónica de barrido. Modificaciones, incluyendo el uso de formamida y pirogalol6 o plomo aspartato7 se han aplicado con éxito para diferentes técnicas de imagen.

El protocolo que aquí combina la cryo-preparación de muestras por HPF y la congelación de sustitución con posterior procesamiento para contraste con tetróxido de osmio/thiocarbohydrazide en acetona a temperatura ambiente asistido por microondas. Nos lo demuestran en el tibialis de nervus myelinated de ratones y en Caenorhabditis elegans, que representan las muestras que requieren alta presión de congelación para conservación ultraestructural de alta calidad. Además, se muestra cómo, después de la deshidratación y la infiltración, las muestras se encajan con como poco posible. Esta resina mínima inclusión8 permite para apuntar más rápido de la estructura de interés y reduce el tiempo empleado en el procesamiento de las muestras, incluyendo menos tiempo requerido para la exposición de la región de interés con la viga de ion. Después de realizar más pasos de preparación de la muestra en el microscopio, la proyección de imagen y molienda de la muestra se lleva a cabo continuamente para adquirir una pila de imágenes. Para la visualización 3D, software (IMOD) de procesamiento de imágenes se utilizan para reconstruir partes del conjunto de datos.

Nuestro flujo de trabajo describe cómo el contraste más adecuado de las muestras para la proyección de imagen de volumen se puede combinar con la mejor preservación ultraestructural por sustitución HPF y congelación. Esto es útil para las muestras que requieren estrictamente cryo-preparación. Aplicaciones se limitan a pequeñas muestras que se pueden preparar por HPF. En muestras de diferente naturaleza, como plantas o microorganismos, este protocolo requiere adaptación.

Protocolo

Todos los experimentos incluyendo muestras de animales descritas aquí han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y la oficina de estado de baja Sajonia para la protección del cliente y seguridad de alimentos (LAVES).

1. alta presión sustitución de congelación y congelación

  1. Diseccionar el tibialis de nervus de un ratón (por ejemplo, C57Bl6N, 12 semanas, mujer)9.
  2. Sumerja el tibialis de nervus en una gota de 20% de polivinilpirrolidona (1 g de PVP en 5 mL) en tampón fosfato salino (PBS) y cortar piezas de 2 mm de longitud. Colocarla en un portamuestras metálico (tipo A, 0,2 mm de profundidad) con unas pinzas finas. Añadir otro portador plano (tipo B) cubierto con una capa delgada de hexadecano como una tapa e inserte este conjunto en el cartucho de muestra.
  3. Transferir varios C. elegans suspendidos en una gota de 20% albúmina sérica bovina (BSA) en M9 (véase Tabla de materiales) con una pipeta de plástico desechable en el portador de metal (tipo A). A continuación, agregar un segundo operador como tapa en la parte superior (tipo B) y montar el cartucho.
  4. Tanto de las muestras, para proceder con lo siguiente: alta presión congelar las Asambleas de portador de muestra uno por uno por la carga en el cartucho de tres piezas en la estación de carga del congelador alta presión. Presione el botón de proceso según instrucciones del fabricante.
    Nota: Ambos tipos de muestras pueden procesarse juntos la substitución posterior congelación.
  5. Coloque las muestras en crioviales de 2 ml de congelados 0,1% de ácido tánico en acetona. Realizar a la transferencia en un baño de nitrógeno líquido sin derramar nitrógeno líquido en los frascos. Transferir los crioviales en un conjunto de10 unidad de congelación automática sustitución a-90 ° C e iniciar el programa.
    Nota: Las muestras se mantienen a-90 ° C 100 h. ácido tánico antes de osmification se utiliza como mordiente para aumentar la absorción de tetróxido de osmio11.
  6. Lavar manualmente las muestras 3 x durante 30 min con 2 mL de acetona a-90 ° C en la unidad de sustitución de congelación.
  7. Dejar las muestras en 2 mL 2% de tetróxido de osmio, 0,1% acetato de uranilo en acetona para tinción continua en el automático congelación unidad de sustitución de 7 h a-90 ° C.
    PRECAUCIÓN: tetróxido de osmio es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, y se debe usar equipo de protección.
    Nota: La unidad de sustitución de congelación automáticamente eleva la temperatura a-20 ° C a 5 ° C por hora. Las muestras se conservan a-20 ° C por 16 h en la unidad de sustitución de congelación. La temperatura se elevará automáticamente a 4 ° C a 10 ° C por hora.
  8. Cambiar la solución de tetróxido de osmio con acetona pura cuando alcanza la temperatura de 4 ° C. Retire los crioviales de la unidad de sustitución de congelación.

2. procesamiento asistida por microondas

Nota: Realice los pasos siguientes a temperatura ambiente12 usando una unidad de control de temperatura para mantener la temperatura estable (véase Tabla de materiales).

  1. Deje los tapones de los tubos de reacción abierta durante el proceso en el microondas.
  2. Tomar los portadores de metal muestra de los crioviales y extraer las muestras de la compañía metal con pinza fina o una aguja, manteniendo las muestras sumergidas en acetona en un recipiente de vidrio de reloj (150 mm).
  3. Transferir las muestras en tubos de reacción de 2 mL con pinzas finas o una pipeta y con 1 mL de acetona cuatro veces para 40 s a 250 w.
    PRECAUCIÓN: Thiocarbohydrazide es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, se debe usar equipo de protección.
  4. Mancha de las muestras con 1 mL de thiocarbohydrazide de 1% en acetona durante 14 minutos a 150 W para aumentar el contraste. Para realizar la tinción, pipetear la solución thiocarbohydrazide en el tubo de reacción, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendida) durante 2 min en/2 min apagado, iterando para total 14 min. Iniciar el microondas.
    Nota: Thiocarbohydrazide reacciona con el tetróxido de osmio que se aplicó durante la sustitución de la congelación. Forma un puente, lo que permite más el tetróxido de osmio que se depositará en el original el tetróxido de osmio sitios13.
  5. Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s a 250 w. pipeta de la acetona en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y seleccione 250 W para 40 s. Inicio el microondas.
  6. Mancha en 1 mL 2% de tetróxido de osmio en acetona durante 14 minutos a 150 w. pipeta de la solución de tetróxido de osmio en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendido) durante 2 min min on/2 off , iterando para total 14 min. Iniciar el microondas.
  7. Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s en 250 W (como hace en el paso 2.5).
  8. Infiltrar 1 ml aumento de concentraciones de resina en acetona (véase Tabla de materiales) de 25%, 50%, 75%, 90%, 100% y 100% por 3 min a 250 w. pipeta de la resina en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de energía l de 250 W (con la función de vacío encendido) para 3 minutos iniciar el microondas.

3. mínima resina incrustar8

  1. Sacar el tibialis de nervus y C. elegans el tubo de reacción con un palillo de dientes y un lugar en una pieza de plástico de la película (véase Tabla de materiales).
  2. Utilice el palillo suavemente empujando la muestra alrededor de en la película plástica hasta que se detecta no hay resina restante. Utiliza una lámpara halógena para calefacción (véase Tabla de materiales) para que la resina se vuelve menos viscosa y es capaz de quitar más fácilmente. Lugar la lámpara halógena lo suficientemente cerca para calentar la resina (teniendo cuidado de no quemar las manos).
  3. Polimerizar las muestras para por lo menos 48 horas a 60 ° C sobre la película de plástico en el horno.

4. preparación para FIB-SEM

  1. Cortar las muestras polimerizadas junto con la película plástica con una cuchilla de afeitar en un tamaño apropiado el trozo de SEM y sujete a los talones de SEM utilizando una resina conductora de plata (véase Tabla de materiales). Polimerizarse nuevamente a 60 º C durante al menos 4 horas o durante la noche.
  2. Capa catódica las muestras en la SEM del trozo de oro durante 1 min a 35 mA mediante un recubridor sputter (también se puede utilizar platino/paladio; basta con una capa gruesa de 10 nm) y colóquelas dentro de la FIB-SEM.

5. data acquisition en el FIB-SEM

  1. Las muestras de la imagen con el detector de electrones secundarios usando el software básico manejo del microscopio (véase Tabla de materiales). La muestra debe ser orientada para que la región de interés (por ejemplo, parte media de los tibialis de nervus o C. elegans) es en el campo de visión.
    Nota: Para realizar la adquisición de datos, incline la etapa a una posición para que la muestra enfrenta a la viga de ion en un ángulo de 90° en una distancia de trabajo adecuada (5 mm) en el punto supuesto de coincidencia de la viga de ion y electrón. Utilizando nuestro instrumento, esto se logra en una inclinación del escenario del 54° y distancia de trabajo de 5 mm.
  2. Para configurar la posición correcta de la muestra, una característica común en una inclinación de 0° mientras que la proyección de imagen del centro con el detector de electrones secundarios. Poco a poco la inclinación a 54° (5°, 20°, 54°), recentrado el mismo objeto moviendo el eje de M.
  3. Buscar el punto de coincidencia de una función mientras que la proyección de imagen de centrado con el detector de electrones secundarios en 54°, seguida hacia la función de la posición central en el modo FIB. Realizar este mostrando el punto de mira en el software de SEM para tener una indicación del centro. Entonces mueva primero la función de la muestra seleccionada para el centro de la imagen mediante la función de punto de centro del software SEM. Entonces centro de la característica a lo largo del eje y moviendo el escenario en z. Cualquier desplazamiento final entre FIB y SEM se corrige con el cambio de la viga de SEM.
  4. Abra el software avanzado (véase Tabla de materiales) para la grabación de conjuntos de datos 3D y siga el Asistente de software paso a paso.
  5. En la región de interés, depósito carbono o platino (400 nm) sobre el ROI utilizando una 3 nA actual permite incluso moler y reducir artefactos inducidos por carga.
    Nota: Mediante la elaboración de la región de interés para ser molido en la superficie del espécimen con la FIB (anchura, altura, profundidad), el software calcula y superpone los tamaños de las funciones de preparación de muestra diferentes, como las trincheras para fresar o zona para deposición de platino/carbón. También, tenga cuidado de la imagen de la superficie de la muestra con corrientes FIB demasiado alta, ya que esto puede dañar la superficie de la muestra. Una corriente de 50 pA es suficiente para la proyección de imagen.
  6. Usa la viga de ion enfocada a una zanja para exponer la región de interés (ROI) utilizando un 15/30 nA actual del molino.
  7. Utilice la viga de ion enfocada para pulir corte transversal con un nA 7 actual.
  8. Después de terminar la preparación de la muestra, configurar los siguientes parámetros de imagen: FIB Fresadoras parámetros en la pestaña de configuración FIB (FIB fresado corriente); SEM imagen parámetros en la ficha Configuración y la imagen ajuste de parámetros en la pestaña de SEM AutoTune (realizar autofocus y autostigmation cada 60 min, tamaño de pixel de 50 nm, tiempo 3, línea 3 de media). Optimizar esto para cada muestra.
  9. Para evitar cualquier deriva térmica haciendo que el bloque de cara a la deriva durante la carrera, salir de la sala durante al menos 2 h antes de iniciar la adquisición.
  10. Adquirir el conjunto de datos en un molino continuo y adquirir modo con un 700 pA FIB actual. Uso 1.5 kV (modo analítico, 900 V) detector de ESB con una tensión de red de 400 V para adquirir imágenes con tamaño de píxel de nm 5 utilizando el software avanzado (véase Tabla de materiales) y grosor de corte de 50 nm. Una adquisición de la imagen tiene aproximadamente 1,5 min con un tiempo de permanencia de 6 μs.
  11. Iniciar la adquisición de datos. Se adquiere una imagen de la FIB en la molienda actual para asegurar que la muestra no se movió y se selecciona la región derecha de interés. Ajustar si es necesario.

6. visualización de datos

  1. Abrir imágenes en Fiji arrastrando la carpeta que contiene todas las imágenes en Fiji y seleccione Pila Virtual.
  2. Cultivos de la región de interés utilizando la herramienta Rectángulo (imagen > cultivos).
  3. Invertir los datos para mostrar el contraste de la microscopia electrónica de transmisión tradicional con membranas en oscuridad (Editar > invertir).
  4. Utilice TrackEM214 (Fiji15) para la alineación. Cargar los datos en TrackEM2 (archivo > Nuevo > TrackEM2) haciendo clic en el capa. Después de todas las imágenes se cargan, alinearlos mediante función de mosaico de múltiples capas (haga clic en imagen > alinear > alinear varias capas mosaico). Después de la alineación, las imágenes se exportan como archivos tiff individuales (haga clic en imagen > exportación > imagen plana marca). Seleccione todas las imágenes que deben ser exportadas y eligen Guardar archivo.
  5. Para procesamiento posterior, utilizar un desenfoque gaussiano (proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano; sigma 2) y aumento del contraste local (proceso > mejorar el contraste Local; CLAHE: tamaño de bloque 127, cubos de histograma 256, pendiente máxima 1.5), que se aplican en Fiji para suavizar la imagen y obtener una mejor relación señal a ruido.
  6. IMOD16 se utiliza para realizar una segmentación manual y visualizar la estructura de interés en 3D. Abra el conjunto de datos en IMOD y seleccione herramientas de dibujo (especial > herramientas de dibujo) para realizar la segmentación manual. Diferentes herramientas manual pueden utilizarse para seguir la estructura de interés en todo el volumen (por ejemplo unir, Sculpt). Usar navegador de imágenes de microscopía (MIB17) para segmentación semiautomática.

Resultados

El flujo de trabajo comienza con una muestra (aquí, un ratón recién disecados nervus tibialis) en portadores metálicos para la congelación de alta presión (Figura 1a). Los portadores son recuperados de nitrógeno líquido (Figura 1b) y colocados en una unidad de sustitución de congelación sobre la química primer congeladora cóctel (figura 1C). Después de una larga congelación protocolo de sustitución, incluyendo 2% de tetraóxido de osmio y 0,1% acetato de uranilo, las muestras se extraen de los portadores a la temperatura ambiente (figura 1 d). Para mejorar el contraste, las muestras se transfieren a tubos de plástico a ser procesado en el microondas (Figura 1e). La cámara de vacío y unidad de control de temperatura se utilizan para optimizar el proceso (figura 1f).

Para poder realizar la incrustación de resina mínimo, se necesitan hojas de película de plástico y palillos de dientes (Figura 2a). Después de infiltrarse en las muestras con resina utilizando el horno de microondas, son colocados en las piezas de la película plástica y movidos alrededor hasta que no quede resina en la superficie de la muestra. Una lámpara halógena se utiliza para drenar la resina restante y dejar la muestra mínimamente integrada (figura 2b) en la película de plástico. Cabe señalar que la resina más quitada de la parte superior de la muestra es buena. Todavía debe haber una pequeña cantidad debajo de la muestra para mantenerla unida al sustrato. La muestra ser polimerizada en la película de plástico se corta y en la parte superior del trozo de SEM con resina conductora de plata (figura 2 c). El trozo se polimeriza durante al menos 4 h a 60 ° C (Figura 2d). Se deben mezclar bien los componentes o la mezcla no puede polimerizar correctamente. Para evitar carga en el microscopio electrónico de barrido, el talón es Farfullar revestido con oro o platino/paladio (figura 2e).

Las muestras se colocan en el FIB-SEM y fotografiadas con un detector de electrones secundarios a la región de interés (figura 3ae). Un haz de iones se utiliza para remover el material directamente en frente de la región de interés para exponer una sección (figura 3b-d, 3f-h). Protocolos estándar a menudo sufren de falta de contraste de la membrana (figura 3bf), mientras que el protocolo mejorado proporciona un contraste fuerte de la membrana (figura 3 c-d, 3 g-h).

Los datos de EM (después de postprocesado) se visualizan con IMOD, una imagen de procesamiento y modelado de programa. Para lograr una mejor comprensión de la información 3D, se utiliza el reslicing virtual de los datos (figura 4a). Diferentes estructuras del conjunto de datos están segmentadas manualmente (Figura 4b-d).

figure-results-1
Figura 1: de alta presión de congelación, congelación-sustitución y transformación asistida por microondas. (a) portador que contiene el tibialis de nervus de ratón de la muestra, la escala bar 3 m m. (b) portamuestras que contiene el tibialis de nervus de ratón después de alta presión congelación, bar 3 mm. (c) automático congelación sustitución (AFS) unidad de escala con las muestras. Recuadro: recipiente de metal por encargo para hasta 23 cubetas y dos frascos grandes de productos químicos en el AFS. (d) muestras de portadores en un plato de cristal en la acetona, la escala bar 3 mm. (e) muestras en tubos de reacción para poner en el microondas para el procesamiento. unidad (f) vacío cámara y control de temperatura del horno de microondas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: incrustación de resina mínima y preparación para el FIB-SEM. (a) plástico y palillos de dientes que se utilizan para la resina mínima inclusión, escala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis vaciado de resina encima de la película plástica, escala bar 250 μm. (c) tibialis de Nervus polimerizado en película plástica, entonces corte y montado sobre el trozo de SEM con resina conductiva de plata, escala bar 250 μm. (d) muestras polimerizadas en la parte superior del trozo de SEM, escala bar 3 mm. (e) las muestras recubiertas con oro en el talón de la SEM, escala bar 3 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: preparación de la muestra dentro de la FIB-SEM. (una e) Imagen secundaria del electrón dentro del FIB-SEM de la muestra de la superficie (a) escala de tibialis de Nervus, barra 100 μm. (e) C. elegans, escala de la barra 2 μm. (b-d) y sección (f-h) a través de muestra utilizando detector de ESB para la proyección de imagen. (b y c) Tibialis de Nervus, escala de la barra 2 μm. (f y g) C. elegans, escala de la barra 1 μm y 200 nm. (b y f) Se muestran los resultados de alta presión congelación y congelación sustitución sin realce, mientras que todas las otras imágenes muestran resultados de sustitución mayor congelación. (d y h) Imagen detallada de la muestra utilizando el detector ESB. (d) tibialis de Nervus, escala de la barra 200 nm. (h) escala de C. elegans, barra 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: adquisición y visualización de la imagen. (a) datos EM IMOD con casi resliced x / z - y y-z-planos, escala de la barra 2 μm. (b) segmentado axones en EM datos (azul) Remak (rojo) de paquetes, envolturas de myelin (amarillo y naranja) y mitocondrias (turquesas), escalan de la barra 3D modelo de 2 μm. (c y d), escala de la barra 2 μm y 500 nm . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo fue desarrollado para ilustrar la conservación óptima y el contraste para realizar la proyección de imagen serial de cara de bloque con un FIB-SEM. Por lo tanto, elegimos aplicar crio-inmovilización seguida de coloración posterior usando sustitución de congelación y tratamiento asistido por microondas. Por lo tanto, este protocolo se limita a las muestras que son lo suficientemente pequeñas como para congelación de alta presión. Por el tamaño de la compañía de la muestra, que coincide con el tamaño de la muestra que se puede congelar correctamente con esta técnica se establecen las limitaciones de tamaño de 3 a 6 mm de ancho y espesor de ~ 200 μm. Esto es relevante para la muestra de nervio de ratón, ya que el nervio ciático es demasiado grande de diámetro para caber en los portadores de 0.2 mm que están obligados a garantizar la congelación adecuada. Por lo tanto, se recomienda la cuidadosa disección de un nervio más pequeños como el nervio tibial u otros nervio fino como el nervio femoral. Puesto que la vaina de mielina es sensible al estiramiento, gran debe tener cuidado durante la disección del nervio fresco y viable para evitar la manipulación de artefactos. En general, deben utilizarse sólo viables muestras para estudios de microscopio electrónico.

Proceso asistido por microondas e incrustación de resina mínima están diseñados para acelerar la preparación y proceso de focalización. El procesamiento asistido por microondas, aplicando un protocolo modificado de OTO4 se utiliza para la fijación química de temperatura ambiente. Un microondas doméstico no dará los mismos resultados, ya que hay una distribución homogénea de las microondas, su temperatura no es controlada, no vacío que puede ser aplicado. El más pequeño una muestra, la mayor penetración de los productos químicos; por lo tanto, los mejores resultados se obtienen muestras más pequeñas. Para evitar daños a la muestra por sobrecalentamiento, control de la temperatura y la aplicación de la potencia del microondas mínimamente requeridos son críticos. Los pasos del proceso asistida por microondas se pueden realizar en el banco si no hay microondas disponibles, que dará lugar a tiempos de procesamiento más largos. A directamente estructuras de destino en el SEM, es crucial eliminar tanta resina como sea posible de la parte superior de la muestra. Después de registrar un conjunto de datos, procesamiento posterior de los datos en bruto es necesario reducir el tamaño del archivo y mejorar la relación señal a ruido. Técnicas de imagen moderno volumen producen grandes cantidades de datos. Por lo tanto, para realizar el procesamiento de datos en forma rápida y suficiente, se necesita suficiente RAM en la estación de trabajo. Para las operaciones de alineación por lo menos dos veces más RAM que el tamaño del conjunto de datos se requiere.

Este protocolo ha sido probado en el tibialis de nervus del ratón así como en C. elegans. Hall et al.. 12 utiliza un paso de mejora similares después de su sustitución de congelar en el Banco para la preparación de C. elegans. Para cualquier otro organismo de modelo como el pez cebra, ajustes del protocolo son probablemente necesarias. Una modificación posible es cambiar la composición de la substitución de freeze coctel, como por la adición de agua que se utiliza para el realce de contraste18. Además, la duración de la sustitución de congelación tiene que estar adaptado a la muestra y puede acortarse considerablemente según la congelación rápida sustitución protocolo19. Una posibilidad es la aplicación de agitación para acelerar la congelación sustitución proceso20. Después de la sustitución de la congelación, otras modificaciones son posibles, como la aplicación repetida de mejora de los productos químicos y el tetróxido de osmio21. Durante el proceso del microondas, se puede variar la potencia, temperatura y tiempos de incubación para optimizar los resultados de la muestra respectiva.

Este protocolo muestra que dicha mejora puede combinarse con otros protocolos de congelación sustitución y diferentes tipos de muestras según lo descrito por Hall12 que se reflejada en un FIB-SEM o por microscopía electrónica de serie de cara de bloque. Estas técnicas de imagen requieren contraste, que es menos importante para microscopía electrónica de transmisión.

Divulgaciones

No hay conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

El FIB-SEM y A.S. (la posición del operador FIB-SEM) son financiados por el Cluster de excelencia y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) centro de investigación a nanoescala microscopia y Fisiología Molecular del cerebro (CNMPB). Agradecemos al laboratorio de Thomas Müller-Reichert para proporcionar las muestras de C. elegans . Agradecemos a Ulrich Weikert para participar en la película.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumentation
Leica HPM100Leica
Microondas de laboratorio Leica
EM ACE600 con objetivo de oroLeica
Lámpara halógena 12 V/ 20 WHorno Osram
VWR
fuerte>congelante
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA2153
M9Hechoen casa según C. Elegans- Un enfoque práctico I.A.Hope
HexadeceneSigma-Aldrich52276
PolivinilpirrolidonaSigma-AldrichP2307
Portador tipo AWohlwend GmbH#241
Soporte tipo BWohlwend GmbH#242
Soporte de hendiduraWohlwend GmbH#446
Pipetas Pasteur de plásticoVWR612-1684
PinzasFST11200-10
Sustitución por congelación
Acetonaservicios científicos10015
Ácido tánicoSigma-Aldrich403040
Tetróxido de osmioEMS19100
Acetato de uraniloSPI-Chem02624-AB
AcetonaEMS10015
TiocarbohidrazidaSigma-Aldrich223220
Nunc CryoTubesSigma-AldrichV7884-450EA
Reloj Platos de cristal, 150 mmVWR216-2189H
Tubos EppendorfEppendorf0030 120.094
Resina DurcupanSigma-Aldrich44610
Montaje
SEM stubs ScienceServicesE75200
AclarScience Services50425-10
Palillos de
papel de filtroVWR512-3618
resina de plata conductoraEMS12670-EEEPO-TEK EE 129-4
SoftwareAdquisición de
imágenesZeissAtlas5 A3D Procesamiento de
imágenesCódigo abiertoFijihttp://fiji.sc/#download
Visualización de imágenesabiertoIMODhttp://bio3d.colorado.edu/imod/
Sustitución automática de congelación con unidad de control de temperatura Ted Pella Crossbeam 540 Zeiss <dientes imágenes Zeiss SmartSEM Adquisición de Código

Referencias

  1. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  2. Möbius, W., Nave, K. -A., Werner, H. B. Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing. Brain Research. 1641, 92-100 (2016).
  3. Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure. Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).
  4. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , Available from: https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol (2010).
  5. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue. Journal of Visualized Experiments. (53), e2588(2011).
  6. Eberle, A. L., et al. High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope. Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).
  7. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 1-7 (2015).
  8. Schieber, N. L., et al. Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging. Methods in Cell Biology. 140, (2017).
  9. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  10. Möbius, W., et al. Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System. Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).
  11. Hayat, M. A. Stains and Cytochemical Methods. , Plenum Press. New York and London. (1993).
  12. Hall, T. J., Hartweig, E., Nguyen, K. C. Q. OTO Fixation for SEM and Blockface Imaging. , Available from: http://www.wormatlas.org/EMmethods/OTOFix.htm (2018).
  13. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  17. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).
  18. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).
  19. Mcdonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).
  20. Reipert, S., et al. Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. , (2018).
  21. Lešer, V., Drobne, D., Pipan, Ž, Milani, M., Tatti, F. Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation. Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Microscopio electr nico de barrido con haz de iones focalizadossustituci n por congelaci ntinci n con tetr xido de osmiotratamiento con tiocarbazidapolimerizaci n de resinalocalizaci n de la muestra

Artículos relacionados