Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Resumen

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.

Resumen

Introducir proteínas de interés en las células en el sistema nervioso es difícil debido a las barreras biológicas innatas que limitan el acceso a la mayoría de las moléculas. Inyección directamente en el tejido de la médula espinal pasa por alto estas barreras, proporcionando acceso a los cuerpos de la célula o sinapsis donde las moléculas pueden ser incorporadas. Combinando tecnología de vector viral con este método permite la introducción de genes de la blanco en tejido nervioso con el fin de la terapia génica o el trazado de vías. Aquí se introduce un virus diseñado para un transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) en las sinapsis de interneuronas propiospinal (PNs) para fomentar el transporte específico para neuronas en la médula espinal y los núcleos del médula oblonga. Dirigidas a PNs aprovecha las numerosas conexiones que reciben de los caminos del motor como los tractos rubroespinal y reticulospinal, así como su interconexión con los demás a lo largo de los segmentos de la médula espinal. Representante de seguimiento utilizando el vector de HiRet con detalles de alta fidelidad de espectáculos constitutivamente activa proteína verde fluorescente (GFP) de cuerpos celulares, axones y cenadores dendríticos PNs torácicas y reticulospinal neuronas en la formación reticular del pontine. HiRet incorpora en vías del médula oblonga y PNs pero muestra integración dependiente de edad en las neuronas del tracto corticoespinal. En Resumen, la inyección de médula espinal usando vectores virales es un método adecuado para la introducción de proteínas de interés en las neuronas de las zonas específicas.

Introducción

Vectores virales son importantes herramientas biológicas que pueden introducir material genético en las células con el fin de compensar los genes defectuosos, proteínas de crecimiento importante de alza o fabricar proteínas marcadoras que ponen de relieve la estructura y conexiones sinápticas del sus objetivos. Este artículo se centra en la inyección directa de un vector lentivirales retrogradely transportable muy eficiente en la médula espinal de rata para resaltar los caminos importantes del motor con trazo fluorescente.  Este método también es muy apropiado para estudios de regeneración y regeneración axonales a introducir proteínas de interés en diversas poblacion....

Protocolo

Todos los procedimientos de atención quirúrgica y animales han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Temple.

1. pre-quirúrgicos preparados

1. Preparar el vidrio tirado agujas para inyección viral unos días antes de la cirugía usando 3,5 nanoliter capilares pipetas de vidrio diseñados para nanoliter inyectores. Tire de cada pipeta en un extractor de aguja de dos pasos según las instrucciones del fabricante para crear dos plantillas de aguja.
2. Afinar la punta de las plantillas de la aguja de corte aproximadamente 1-2 mm de exceso de vidrio con microscissors. Tamaño de apertura aproximada ....

Resultados

Transducción de una población robusta de unilaterales neuronas en la médula espinal y en ciertos núcleos del tronco encefálico deben resultar exitosa inyección y transporte de los vectores virales. Figura 1 muestra etiquetas estereotipadas de las neuronas y los axones de la médula espinal torácica y en la formación reticular del pontine del médula oblonga en inyección después de cuatro semanas. Significativa expresión de GFP se observa en las neuronas en la sustancia gris.......

Discusión

Manipulación genética de las neuronas en el cerebro y la médula espinal ha servido para destacar sensorial, motor y autonómicas vías mediante trazo fluorescente y explorar potencial de rebrote de tractos neuronales después de lesiones^{27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33}. dirigir la inyección de un .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#10 Hojas de bisturí	Roboz	RS-9801-10	Para usar con el bisturí.
Jeringas de 1 mL	Becton, Dickinson and Company 309659		Para inyección de IP anestésico, posibles inyecciones de refuerzo de anestésicos e inyecciones de antibióticos.
Jeringas de 10 ml	Becton, Dickinson and Company	309604	Para inyectar solución salina en el animal, después de la cirugía.
4.0 Sutura Crómica Catgut	DemeTECH	NN374-16	Para volver a unir el músculo durante el cierre.
48000 Micropipeta Biseladora	World Precision Instruments	32416	Se utiliza para biselar las puntas de los tubos capilares de vidrio estirado para formar agujas de vidrio funcionales.
Solución de yodo al 5% Productos	Purdue L.P.	L01020-08	Para uso en la esterilización del sitio quirúrgico.
70% Etanol N	/A	N/A	Para la esterilización de agujas de vidrio recién preparadas, modelos animales durante la preparación quirúrgica y manos del cirujano durante la cirugía, así como todos los demás mantenimientos menores de la esterilidad.
Anestésico (Solución de Ketamina/Xilacina)	Zoetis	240048	Para mantener al animal en el plano correcto de conciencia durante la cirugía.
Antibiótico (Cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Se inyecta por vía subcutánea para prevenir infecciones después de la cirugía.
Esterilizador de perlas	CellPoint	5-1450	Para esterilizar instrumental quirúrgico con calor.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Para sellar el hueso en caso de sangrado óseo.
Cauterizador	Fine Science Tools	18010-00	Para sellar cualquier arteria o vena cortada durante una cirugía para evitar la pérdida excesiva de sangre.
Báscula digital	Okaus	REV.005	Para pesar al animal durante la preparación quirúrgica.
Accesorio de aguja flexible	World Precision Instruments	MF34G-5	Para limpiar agujas de vidrio y cargar aceite rojo en agujas de vidrio.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Para sellar el hueso en caso de sangrado óseo.
Tubos capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878	Para agujas de vidrio estiradas: deben diseñarse para inyectores de nanolitros.
Cortapelos	Oster	111038-060-000	Para limpiar el sitio quirúrgico de cabello.
Hemostáticos	Roboz	RS-7231	Para uso general en cirugía.
Kimwipes	Kimtech	34155	Para uso general en cirugía.
Pinza curva de punta media	Roboz	RS-5136	Para uso general en cirugía.
Micromanipulador con escala Vernier Kanetec		N/A	Para una orientación precisa durante la cirugía.
Microtijeras	Roboz	RS-5621	Para cortar látigos de vidrio de tubos capilares de vidrio recién extraídos.
Microscopio con Escala de Luz y Vernier Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Se utiliza para visualizar y medir el biselado de tubos capilares de vidrio estirados en agujas de vidrio funcionales.
Controlador de bomba de microjeringa	World Precision Instruments	62403	Para controlar la velocidad de inyección.
Nanolitro 2000 Inyector de cabeza de bomba	World Precision Instruments	500150	Para cargar e inyectar virus de forma controlada.
Extractor de agujas	Narishige	PC-100	Para calentar y separar tubos capilares de vidrio para formar agujas de vidrio.
Pomada Oftalámica	Dechra Productos Veterinarios	RAC 0119	Para proteger los ojos del animal durante la cirugía.
Parafilm	Bemis	PM-996	Para ayudar con la carga del virus en el nanoinyector.
Agujas PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Para usar con las jeringas de 1 ml y 10 ml para permitir la inyección del modelo animal.
Pinza de dientes de rata	Roboz	RS-5152	Para agarre de apófisis espinosas.
Aceite rojo	N/A	N/A	Para proporcionar un frente para la visualización del virus que ingresa al tejido durante la inyección.
Retractores	Roboz	RS-6510	Para mantener abierta la herida quirúrgica.
Rimadyl Comprimidos Bio	Serv	MP275-050	Para el tratamiento del dolor postoperatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Para extraer músculo de la columna vertebral durante la cirugía.
Mango de hoja de bisturí	Roboz	RS-9843	Para cortar la piel abierta y la almohadilla de grasa del modelo animal durante la cirugía.
Tijeras	Roboz	RS-5980	Para uso general en cirugía.
Pinzas de acero inoxidable para heridas	CellPoint	201-1000	Para unir la piel de la herida quirúrgica durante el cierre.
Pinzas de extracción de grapas	Kent Scientific INS750347		Para quitar las grapas, en caso de que se hayan aplicado incorrectamente.
Tela estéril	Phenix Research Products	BP-989	Para proporcionar una superficie estéril para la operación.
Aplicadores estériles con punta de algodón	Puritan	806-WC	Para absorber la sangre en la herida quirúrgica manteniendo la esterilidad.
Gasa estéril	Covidien	2146	Para limpiar el área quirúrgica y las herramientas quirúrgicas manteniendo la esterilidad.
Solución salina estéril	Baxter Healthcare Corporation 281324		Para usar en la limpieza de la sangre y para reemplazar líquidos después de la cirugía.
Guantes quirúrgicos	N/A	N/A	Para uso del cirujano para mantener el campo estéril durante la cirugía.
Almohadilla térmica quirúrgica	N/A	N/A	Para mantener la temperatura corporal del modelo animal durante la cirugía.
Microscopio quirúrgico	N/A	N/A	Para una mejor visualización de la herida quirúrgica.
Grapadora quirúrgica	Kent Scientific	INS750546	Para aplicar las grapas.
T / Bomba de agua de terapia de calor	Gaymar	TP500C	Para bombear agua caliente en la almohadilla de calentamiento por convección de agua.
Almohadilla de calentamiento por convección de agua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Para uso en el área de recuperación postoperatoria para mantener la temperatura corporal del animal inconsciente.
Ganchos ponderados	N/A	N/A	Para mantener abierta la herida quirúrgica.