Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Resumen

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.

Resumen

Introducir proteínas de interés en las células en el sistema nervioso es difícil debido a las barreras biológicas innatas que limitan el acceso a la mayoría de las moléculas. Inyección directamente en el tejido de la médula espinal pasa por alto estas barreras, proporcionando acceso a los cuerpos de la célula o sinapsis donde las moléculas pueden ser incorporadas. Combinando tecnología de vector viral con este método permite la introducción de genes de la blanco en tejido nervioso con el fin de la terapia génica o el trazado de vías. Aquí se introduce un virus diseñado para un transporte retrógrado altamente eficiente (HiRet) en las sinapsis de interneuronas propiospinal (PNs) para fomentar el transporte específico para neuronas en la médula espinal y los núcleos del médula oblonga. Dirigidas a PNs aprovecha las numerosas conexiones que reciben de los caminos del motor como los tractos rubroespinal y reticulospinal, así como su interconexión con los demás a lo largo de los segmentos de la médula espinal. Representante de seguimiento utilizando el vector de HiRet con detalles de alta fidelidad de espectáculos constitutivamente activa proteína verde fluorescente (GFP) de cuerpos celulares, axones y cenadores dendríticos PNs torácicas y reticulospinal neuronas en la formación reticular del pontine. HiRet incorpora en vías del médula oblonga y PNs pero muestra integración dependiente de edad en las neuronas del tracto corticoespinal. En Resumen, la inyección de médula espinal usando vectores virales es un método adecuado para la introducción de proteínas de interés en las neuronas de las zonas específicas.

Introducción

Vectores virales son importantes herramientas biológicas que pueden introducir material genético en las células con el fin de compensar los genes defectuosos, proteínas de crecimiento importante de alza o fabricar proteínas marcadoras que ponen de relieve la estructura y conexiones sinápticas del sus objetivos. Este artículo se centra en la inyección directa de un vector lentivirales retrogradely transportable muy eficiente en la médula espinal de rata para resaltar los caminos importantes del motor con trazo fluorescente.  Este método también es muy apropiado para estudios de regeneración y regeneración axonales a introducir proteínas de interés en diversas poblaciones de neuronas y se ha utilizado para silenciar a las neuronas para mapeo funcional estudios^1,2.

Muchos de los detalles anatómicos de las vías motor espinales fueron aclados mediante estudios de inyección directa con marcadores clásicos como la BDA y fluoro-oro^{3,4,5,6,7 , 8}. estos marcadores se consideran patrón oro pero pueden tener ciertas desventajas como la absorción por axones dañados, o axones en pasaje de la materia blanca circundante una inyección sitio^9,10,11 . Esto podría llevar a interpretaciones incorrectas de la conectividad vía y puede ser un inconveniente en los estudios de regeneración donde podría confundir con absorción de tinte por axones dañados o cortadas para regenerar las fibras durante el más adelante análisis¹².

Vectores lentivirales son populares en estudios de terapia génica, ya que proporcionan la expresión estable y a largo plazo en poblaciones neuronales^{13,14,15,16,17,18 ,19}. Sin embargo, tradicionalmente envasados vectores lentivirales puede haber limitado el transporte retrógrado y dispare la respuesta del sistema inmunitario cuando se utiliza en vivo^4,20,21. Un vector de transporte retrógrado muy eficiente llamado HiRet ha sido producido por Kato et mediante la modificación de la envuelta viral con una glicoproteína del virus rabia para crear un vector híbrido que mejora el transporte retrógrado^22,23.

Trazado retrógrado introduce un vector en el espacio sináptico de la neurona de destino, lo que le permite ser tomado por el axón de la célula y transportados al cuerpo de la célula. Ha demostrado éxito transporte de HiRet de sinapsis neuronales en los cerebros de ratones y primates^23,24 y de los músculos en las neuronas de motor²². Este protocolo muestra la inyección en la médula espinal lumbar, específicamente dirigidos a los terminales sinápticos de propiospinal interneuronas y las neuronas del tronco encefálico. PNs reciban conexiones de muchos diferentes vías espinales y por lo tanto pueden ser utilizados para una diversa población de neuronas en la médula espinal y tronco encefálico. Etiquetado las neuronas en este estudio representan circuitos inervan motoneuronas piscinas relativos a la función motora del miembro posterior. Etiquetado sólido se observa en la médula espinal y tronco encefálico, incluyendo datos de alta fidelidad de cenadores dendríticos y terminales de axón. También hemos utilizado este método en estudios anteriores de la médula espinal cervical para etiqueta propiospinal y del médula oblonga reticulospinal vías²⁵.

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral en la médula espinal lumbar de una rata. Como se ve en la película 1, la incisión es dirigida por la identificación de la vértebra L1 situada en la última costilla. Esto se utiliza como una señal caudal para una incisión de 3-4 cm que expone la musculatura sobre la médula espinal de L1-L4. Laminectomies de los aspectos dorsales de las vértebras T11-T13 se realizan y se dirige una aguja de vidrio biselado 0.8 mm lateral de la línea media y reducido 1,5 mm en la materia gris para inyectar virus.

Protocolo

Todos los procedimientos de atención quirúrgica y animales han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Temple.

1. pre-quirúrgicos preparados

1. Preparar el vidrio tirado agujas para inyección viral unos días antes de la cirugía usando 3,5 nanoliter capilares pipetas de vidrio diseñados para nanoliter inyectores. Tire de cada pipeta en un extractor de aguja de dos pasos según las instrucciones del fabricante para crear dos plantillas de aguja.
2. Afinar la punta de las plantillas de la aguja de corte aproximadamente 1-2 mm de exceso de vidrio con microscissors. Tamaño de apertura aproximada de medida bajo un microscopio con un portaobjetos calibrado para aislar las agujas con las aberturas de 30-40 μm.
3. Con la aguja colocada a 30°, utilice un biselador de micropipeta para crear una punta con una abertura de 30-40 μm y un ángulo biselado de 45°. Verificar el ancho de la abertura con el nonio en la diapositiva de calibración. Pasar agua y etanol a través de la aguja de vidrio utilizando una jeringa con un accesorio de aguja flexible para limpiar escombros y marque la aguja a intervalos regulares con un marcador negro.
4. Colocar las agujas en un plato de Petri cubierto previamente limpiadas con etanol al 70% y esterilizar durante 30 minutos en una campana de bioseguridad bajo luz UV.
5. Preparar HiRet lentivirus eliminando un volumen adecuado del congelador inmediatamente antes del procedimiento.
   Nota: Un volumen adecuado incluye la cantidad necesaria para la inyección (inyección de 1 μl x número de inyecciones) más un poco de volumen extra para tener en cuenta para el pipeteo y pérdidas de carga. Transportar y almacenar el virus en el hielo cuando no esté en uso.
6. Preparar el inyector, conectando al Microbomb y colocarlo en un instrumental quirúrgico con una escala Vernier.
7. Preparar la aguja de vidrio, cuidadosamente cargar un tinte color como rojo aceite con una jeringa equipada con una aguja flexible. Asegurar que no hay burbujas en la aguja. Utilizar técnica aséptica al manipular la aguja y abstenerse de tocar la punta.
8. Inserte la aguja de vidrio en el inyector, asegurándose que la aguja está colocada correctamente en las arandelas de la tapa del inyector esté bien apretado y la aguja del inyector de acero se extiende aproximadamente ¾ la longitud de la aguja de vidrio. Virus puede ser cargado en la aguja en un paso posterior.

2. anestesia y preparación del sitio quirúrgico

1. Pesar al animal en una escala digital. Registrar el peso preoperatorio para determinar el volumen de anestésico necesaria y para permitir un control de después de la cirugía peso. Ratas Sprague-Dawley hembras aproximadamente 200 – 250 g fueron utilizados en el presente Protocolo.
2. Anestesiar la rata mediante inhalación isoflurano o una solución de ketamina/xilacina inyectada (k / x). Aquí, la ketamina se inyecta por vía intraperitoneal a 67 mg/kg y xilacina a 6,7 mg/kg dosis.
3. Confirmar un adecuado plano anestésico pellizcando los pies firmemente. Si se produce la retirada reflexiva, esperar unos minutos adicionales antes de proceder.
   Nota: Observe también los bigotes, ojos y la frecuencia respiratoria signos de conciencia. Si los bigotes son fasciculaciones, el ojo parpadea cuando se toca suavemente o la respiración es rápida y poco profunda, espere a que el plano anestésico es más profundo para continuar con el protocolo. También monitorizar estas señales a través de la cirugía laminectomía e inyección. Si el animal muestra un plano anestésico superficial, administrar una vacuna de refuerzo de ketamina sólo igual a 1/2 la original k / x dosis.
4. Afeitarse la rata a lo largo de la línea media dorsal desde la cadera hasta el ángulo inferior de la escápula. Tire de la piel del animal tenso para un afeitado más fácil y más preciso.
5. Aplicar pomada oftálmica en ambos ojos.
6. Aplicar antiséptico en la zona depilada para esterilizar el sitio. Para la primera limpieza, empape una gasa estéril con una solución de yodo al 5% y limpie a todo cabello y los residuos. Siga esto con un suave movimiento circular unidireccional con una gasa estéril empapada en etanol al 70%, por lo que ningún área se pone en contacto dos veces. Utilice esta misma técnica con alternancia de yodo y gasas empapadas de etanol dos veces más.

3. quirúrgica preparación campo e instrumento

1. Preparar un conjunto de herramientas quirúrgicas en autoclave que incluyan un bisturí, gubias, pinzas de diente de rata, primavera tijeras, pinzas hemostáticas, pinzas de punto medio curvado y retractores o los ganchos ponderadas por desenvolver la envoltura estéril para crear un campo estéril.
2. Abra un paquete de guantes quirúrgicos estériles y coloque la envoltura de guante estéril sobre la mesa. Utilice esto como un campo estéril adicional para herramientas usadas para prevenir la contaminación de la envoltura estéril.
3. Caída de una hoja de bisturí #10 sobre el campo estéril. Fije la hoja a un mango con un hemostato. Solución salina estéril posición 4,0 sutura catgut crómico y materiales para control de sangrado como un cauterizador, gasa estéril, aplicadores con punta de algodón estériles (para hemorragias del músculo), o gelfoam o bonewax (para hemorragias de hueso) en un lugar accesible.
4. Recuperar al animal y ponerlo en un paño estéril. Colocar una gasa debajo de la vejiga para recoger la orina. Apuntalar la zona de destino con una toalla enrollada debajo del abdomen. Si está disponible, coloque una almohadilla de calefacción quirúrgica debajo el paño estéril, especialmente para procedimientos más largos.
   Nota: Esterilidad es importante durante la cirugía de la supervivencia. Mantenga una botella de spray de etanol al 70% en la mano para mantener la esterilidad de las manos enguantadas y un esterilizador de bolas de uso si se compromete la esterilidad de los instrumentos, o entre cirugías individuales.

4. exponer la columna vertebral e identificar el sitio de laminectomía

1. Identificar el área donde se realizará una incisión en la piel presionando los dedos suavemente en la última costilla a localizar la vértebra L1. Usando esto como una señal, hacer una incisión en la piel 3-4 cm con un bisturí #10 terminando apenas inferior a la L1 para exponer el músculo. Sostenga la piel tensa por separarse suavemente y presione firmemente con la hoja de bisturí para asegurar una limpia incisión.
2. Corte y extensión superficial grasa con fórceps y tijeras si es necesario. (Dependiendo de vértebra de destino, puede o no ser una gran almohadilla grasa superficial al músculo).
3. Siento por las apófisis espinosas con la parte plana de la hoja de bisturí o un dedo. A menudo el área de la línea media se esbozarse una "v" de la faja blanca a cada lado. Hacer un pequeño corte rostral para dejar espacio agarrar firmemente en un proceso superior con pinzas de diente de rata, y luego hacer 2 cortes largos y profundos cerca de los procesos como sea posible. En el punto más profundo del corte, la superficie dorsal de las vértebras se puede sentir con la hoja de bisturí.
4. Mantenga los músculos laterales a un lado con separadores o ganchos ponderados para mejorar la visibilidad. Músculo claro alrededor de los procesos con un bisturí, tijeras de muelle o gubias para determinar la forma de sus cabezas.
   Nota: Recuerde que la médula espinal no se extiende a toda la longitud de la columna vertebral, como paradas de tejido médula espinal creciente anteriormente en el desarrollo de hueso. Esto significa que el nivel de la columna vertebral puede ser debajo de una vértebra diferente nombre.
5. Localice el T11 y los procesos adyacentes de T12 y T13.
   Nota: Ayuda en la orientación correcta niveles vertebrales se puede encontrar en un atlas de la médula espinal de rata y estudios previos sobre puntos de interés en el ratón, que tiene una muy parecida estructura vertebral^6,33. Deje una apófisis rostral como T9 dar un punto de referencia la línea media.

5. realizar una laminectomía

1. Una vez que el área de la blanco ha sido correctamente identificado, realizar laminectomies de los aspectos dorsales de T11-T13. Extender suavemente las vértebras para revelar los ligamentos intervertebrales, que son buenos sitios para insertar gubias para la picadura inicial del hueso. Sujete las gubias en posición medio cerrado para aumentar el control de la multa.
2. Eliminar los procesos espinosos y el aspecto dorsal de las vértebras por tomar pequeños bocados con las gubias. Tenga cuidado de no dañar la médula espinal o molestar a la duramadre. Levante ligeramente con las pinzas de diente de rata para ayudar a tirar la médula espinal de las vértebras y disminuir la tendencia a golpear el tejido de la médula espinal.
3. Quitar hueso de la línea media para que se observan los vasos sanguíneos de la línea media. Deja una ventana que claramente muestra el tejido de la médula espinal y está libre de residuos.
4. Toque suavemente la médula espinal con el fórceps. Algunos animales pueden saltar reflexivamente aunque su plano anestésico es profundo. Aplicar unas gotas de un agente anestésico como la lidocaína directamente a la médula espinal para evitar saltos durante el procedimiento de inyección.
5. Asegure el animal en un soporte de columna de sujeción pinzas estabilizadoras a apófisis rostrales y caudales a la ventana de laminectomía. Levantar el abdomen del animal usando el soporte espinal para negar el efecto de los movimientos de respiración. Esto aumenta la estabilidad de la aguja y asegurar la adecuada profundidad de la inyección.

6. carga del virus y el posicionamiento del inyector

1. Cargar virus en el inyector de pipeteo aproximadamente 5 μl sobre un trozo de parafilm y posicionando la aguja para que la punta está dentro de la gota.
2. Utilizar el microbomb para retirar hasta 4 μL del virus a una tasa de 20 – 100 nL/s.
3. Ajuste el regulador a inyectar y suelte una pequeña cantidad del virus de la aguja para asegurar que la punta de la aguja se obstruya. Limpiar virus de exceso con una toallita de laboratorio.
   Nota: Una jeringa Hamilton con una aguja de acero puede usarse como alternativa a las pipetas de vidrio tiradas.
4. Coloque el instrumental quirúrgico para que la escala Vernier está visible y coloque la aguja en el midline de la médula espinal.
   Nota: La línea media puede situarse a veces por un vaso sanguíneo grande en la superficie anterior de la médula espinal. Sin embargo, esto puede variar en ratas individuales, y dirigidos a la línea media deben ser confirmado por comparación con un proceso espinoso intacto.
5. Dirigir la aguja lateralmente por 0,8 mm utilizando la escala de nonio en el micromanipulador.
6. Baje la aguja en la médula espinal hasta que es sangría, pero no pinchar, la dura. Usando un movimiento de giro rápido, punción la duramadre con la aguja hasta que se ha hundido a una profundidad de 1,5 mm.

7. inyectar el virus en la médula espinal

1. Una vez que la aguja esté en su lugar, programa el inyector para inyectar a una velocidad de 400 nL/min Confirm que el virus entra en la médula espinal, observando el avance del frente del tinte. Debe haber ninguna obvia salida o protrusión de tejido de la médula espinal. Si se observa fuga, a veces esto puede paliar mediante la reducción de la velocidad de inyección a 200 nL/min.
2. Una vez terminada la inyección, que la aguja en la médula espinal 2 – 5 minutos (dependiendo del volumen inyectado) para facilitar la difusión del virus.
3. Lentamente retire la aguja y pasar al siguiente sitio de la inyección. Inyectar 1 μl del virus en cada uno de los 6 sitios uniformemente espaciados aproximadamente 1 mm de separación a lo largo de la longitud de los tejidos espinales L1-L4. Puede utilizarse la misma aguja para cada inyección mientras continúa funcionar correctamente.

8. cuidado post quirúrgico y cierre de la herida

1. Quitar el animal del soporte del espinal y quitar separadores o ganchos utilizados para extender el músculo lateral. Asegúrese de que la herida esté libre de todos escombros antes de cerrar.
2. Suturar el músculo utilizando una sutura de catgut crómico 4.0. Cortar hilos de sutura cerca del nudo para reducir la probabilidad de irritación de la piel interna.
3. Sujete con grapa la piel cerrada usando los clips de 9 mm de la herida. Para lograr la curación óptima, alinee los bordes de la piel antes de grapar.
4. Coloque el animal en una convección de agua calienta el pad y el monitor hasta que despierto.
5. Inyectar 5-10 mL de solución salina estéril por vía subcutánea para reponer líquidos y un antibiótico como cefazolina para prevenir la infección. Cuando el animal es ambulatoria, coloque en su jaula casera y proporcionar analgésicos iniciales.  Controlar las ratas para cualquier signo de dolor y angustia y tratar según su procedimiento IACUC aprobado para el alivio del dolor.

Resultados

Transducción de una población robusta de unilaterales neuronas en la médula espinal y en ciertos núcleos del tronco encefálico deben resultar exitosa inyección y transporte de los vectores virales. Figura 1 muestra etiquetas estereotipadas de las neuronas y los axones de la médula espinal torácica y en la formación reticular del pontine del médula oblonga en inyección después de cuatro semanas. Significativa expresión de GFP se observa en las neuronas en la sustancia gris...

Discusión

Manipulación genética de las neuronas en el cerebro y la médula espinal ha servido para destacar sensorial, motor y autonómicas vías mediante trazo fluorescente y explorar potencial de rebrote de tractos neuronales después de lesiones^{27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33}. dirigir la inyección de un ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#10 Hojas de bisturí	Roboz	RS-9801-10	Para usar con el bisturí.
Jeringas de 1 mL	Becton, Dickinson and Company 309659		Para inyección de IP anestésico, posibles inyecciones de refuerzo de anestésicos e inyecciones de antibióticos.
Jeringas de 10 ml	Becton, Dickinson and Company	309604	Para inyectar solución salina en el animal, después de la cirugía.
4.0 Sutura Crómica Catgut	DemeTECH	NN374-16	Para volver a unir el músculo durante el cierre.
48000 Micropipeta Biseladora	World Precision Instruments	32416	Se utiliza para biselar las puntas de los tubos capilares de vidrio estirado para formar agujas de vidrio funcionales.
Solución de yodo al 5% Productos	Purdue L.P.	L01020-08	Para uso en la esterilización del sitio quirúrgico.
70% Etanol N	/A	N/A	Para la esterilización de agujas de vidrio recién preparadas, modelos animales durante la preparación quirúrgica y manos del cirujano durante la cirugía, así como todos los demás mantenimientos menores de la esterilidad.
Anestésico (Solución de Ketamina/Xilacina)	Zoetis	240048	Para mantener al animal en el plano correcto de conciencia durante la cirugía.
Antibiótico (Cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Se inyecta por vía subcutánea para prevenir infecciones después de la cirugía.
Esterilizador de perlas	CellPoint	5-1450	Para esterilizar instrumental quirúrgico con calor.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Para sellar el hueso en caso de sangrado óseo.
Cauterizador	Fine Science Tools	18010-00	Para sellar cualquier arteria o vena cortada durante una cirugía para evitar la pérdida excesiva de sangre.
Báscula digital	Okaus	REV.005	Para pesar al animal durante la preparación quirúrgica.
Accesorio de aguja flexible	World Precision Instruments	MF34G-5	Para limpiar agujas de vidrio y cargar aceite rojo en agujas de vidrio.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Para sellar el hueso en caso de sangrado óseo.
Tubos capilares de vidrio	World Precision Instruments	4878	Para agujas de vidrio estiradas: deben diseñarse para inyectores de nanolitros.
Cortapelos	Oster	111038-060-000	Para limpiar el sitio quirúrgico de cabello.
Hemostáticos	Roboz	RS-7231	Para uso general en cirugía.
Kimwipes	Kimtech	34155	Para uso general en cirugía.
Pinza curva de punta media	Roboz	RS-5136	Para uso general en cirugía.
Micromanipulador con escala Vernier Kanetec		N/A	Para una orientación precisa durante la cirugía.
Microtijeras	Roboz	RS-5621	Para cortar látigos de vidrio de tubos capilares de vidrio recién extraídos.
Microscopio con Escala de Luz y Vernier Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Se utiliza para visualizar y medir el biselado de tubos capilares de vidrio estirados en agujas de vidrio funcionales.
Controlador de bomba de microjeringa	World Precision Instruments	62403	Para controlar la velocidad de inyección.
Nanolitro 2000 Inyector de cabeza de bomba	World Precision Instruments	500150	Para cargar e inyectar virus de forma controlada.
Extractor de agujas	Narishige	PC-100	Para calentar y separar tubos capilares de vidrio para formar agujas de vidrio.
Pomada Oftalámica	Dechra Productos Veterinarios	RAC 0119	Para proteger los ojos del animal durante la cirugía.
Parafilm	Bemis	PM-996	Para ayudar con la carga del virus en el nanoinyector.
Agujas PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Para usar con las jeringas de 1 ml y 10 ml para permitir la inyección del modelo animal.
Pinza de dientes de rata	Roboz	RS-5152	Para agarre de apófisis espinosas.
Aceite rojo	N/A	N/A	Para proporcionar un frente para la visualización del virus que ingresa al tejido durante la inyección.
Retractores	Roboz	RS-6510	Para mantener abierta la herida quirúrgica.
Rimadyl Comprimidos Bio	Serv	MP275-050	Para el tratamiento del dolor postoperatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Para extraer músculo de la columna vertebral durante la cirugía.
Mango de hoja de bisturí	Roboz	RS-9843	Para cortar la piel abierta y la almohadilla de grasa del modelo animal durante la cirugía.
Tijeras	Roboz	RS-5980	Para uso general en cirugía.
Pinzas de acero inoxidable para heridas	CellPoint	201-1000	Para unir la piel de la herida quirúrgica durante el cierre.
Pinzas de extracción de grapas	Kent Scientific INS750347		Para quitar las grapas, en caso de que se hayan aplicado incorrectamente.
Tela estéril	Phenix Research Products	BP-989	Para proporcionar una superficie estéril para la operación.
Aplicadores estériles con punta de algodón	Puritan	806-WC	Para absorber la sangre en la herida quirúrgica manteniendo la esterilidad.
Gasa estéril	Covidien	2146	Para limpiar el área quirúrgica y las herramientas quirúrgicas manteniendo la esterilidad.
Solución salina estéril	Baxter Healthcare Corporation 281324		Para usar en la limpieza de la sangre y para reemplazar líquidos después de la cirugía.
Guantes quirúrgicos	N/A	N/A	Para uso del cirujano para mantener el campo estéril durante la cirugía.
Almohadilla térmica quirúrgica	N/A	N/A	Para mantener la temperatura corporal del modelo animal durante la cirugía.
Microscopio quirúrgico	N/A	N/A	Para una mejor visualización de la herida quirúrgica.
Grapadora quirúrgica	Kent Scientific	INS750546	Para aplicar las grapas.
T / Bomba de agua de terapia de calor	Gaymar	TP500C	Para bombear agua caliente en la almohadilla de calentamiento por convección de agua.
Almohadilla de calentamiento por convección de agua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Para uso en el área de recuperación postoperatoria para mantener la temperatura corporal del animal inconsciente.
Ganchos ponderados	N/A	N/A	Para mantener abierta la herida quirúrgica.