Method Article

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

DOI:

10.3791/59173

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April 1st, 2019

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1Department of Otolaryngology Head & Neck Surgery, Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3Center for Regenerative Medicine, Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 4Center for Perinatal Research, Nationwide Children's Hospital, 5Nanofiber Solutions, Inc., 6Department of Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Abstract

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Opciones de tratamiento para los defectos traqueal congénita o secundaria larga del segmento históricamente han limitado debido a una incapacidad para reemplazar tejido funcional. Ingeniería de tejidos es muy prometedor como una posible solución con su capacidad para integrar las células y moléculas de señalización en un andamio de 3 dimensiones. Trabajo reciente con ingeniería tisular traqueal injertos (TETGs) ha visto cierto éxito, pero su traducción ha estado limitada por la estenosis del injerto, injerto el colapso y retrasa la epitelización. Con el fin de investigar los mecanismos de conducción de estas cuestiones, hemos desarrollado un modelo de ratón para la implantación de prótesis traqueal de ingeniería tisular. TETGs fueron construidos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) y poliuretano (PU) en una mezcla de PET y PU (20:80 peso de por ciento). Andamios entonces fueron sembrados utilizando células mononucleares de médula ósea aisladas de 6-8 semanas-viejos ratones C57BL/6 por centrifugación del gradiente. 10 millones de células por injerto fueron sembradas en el lumen del andamio y permitir incubar durante la noche antes de la implantación entre el tercer y séptimo traqueal. Estos injertos eran capaces de recapitular los resultados de la estenosis y retrasa la epitelización según lo demostrado por análisis histológico y la falta de queratina 5 y 14 de queratina las células epiteliales basales en la inmunofluorescencia. Este modelo servirá como una herramienta para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la remodelación de la sede.

Introduction

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Defectos traqueales de segmento largo se presentan como condiciones congénitas raras como anillos traqueales completos y agenesia traqueal, así como traumatismo, malignidad e infección. Cuando superior a 6 cm en adultos o 30% de la longitud traqueal en niños, estos defectos no pueden ser tratados por la reconstrucción quirúrgica. Intentos de sustituir las vías respiratorias con tejido autólogo, trasplante cadavérico y construcciones artificiales han sido plagados por infección crónica, granulación, falla mecánica y la estenosis.

Ingeniería tisular traqueales injertos (TETGs) potencialmente pueden abordar estos problemas, evitando la necesid....

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Protocol

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital de niños en todo el país.

1. fabricación de andamios

  1. Preparar una solución de precursor de nanofibras de polímeros por: 1) disolver 8 wt % PET 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol y calentar la solución a 60 ° C y disolviendo 2) 3% wt PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol a temperatura ambiente.
  2. Una vez enfriado, se combinan las soluciones para crear una mezcla final del polímero de PET y PU (20:80).
  3. Electrospin la solución PU PET+ en una varilla de acero inoxidable (1 mm de diámetro) utili....

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Results

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La figura 1 muestra un esquema de TETG siembra e implantación. La médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6 y cultivadas en vitro. BM-multinacionales fueron aisladas por centrifugación de densidad y sembradas en el TETG. TETGs sembrados fueron implantados en un ratón receptor syngeneic de C57BL/6.

Figura 2 es un resumen del andamio TETG PET:PU proceso de fab.......

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Discussion

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El desarrollo de un modelo de ratón para traquear de ingeniería tisular es esencial en la comprensión de los factores que han limitado la traducción clínica de las TETGs; es decir, colapso del injerto, estenosis y epitelización retardada4. Algunos factores que contribuyen a estas limitaciones incluyen la selección del material de injerto, proceso de fabricación, diseño de andamio y célula siembra protocolos. Este modelo permite la más rápida evaluación de estos factores para entender los mecanismo.......

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Disclosures

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Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

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Nos gustaría reconocer Robert Strouse y la división de innovaciones en el Hospital de niños en todo el país por su apoyo y soluciones de información de investigación en diseño gráfico. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (NHLBI K08HL138460).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inyección de cloruro de sodio al 0,9%APP PharmaceuticalsNDC 63323-186-10
pipeta serológica de 10 ccFalcon357551
18G 1,5 pulgadas. AgujaBD305190
Jeringa de 1 mlBD309659
placa de 24 pocillosCorning3526
25cc pipeta serológicaFalcon356535
25G 1 pulg. AgujaBD305125
tubo 50ccBD352070
Almohadillas de preparación con alcoholFisher HealthcareNDC 69250-661-02
Solución de Baytril (enrofloxacina)Bayer Healthcare, LLCNDC 0859-2267-01
Sutura de monofilamento de poliamida negra, 9-0AROSurgical Instruments CorporationT05A09N10-13
C57BL/ 6, mujeresJackson laboratories6646-8 semanas de edad
Tampón de citrato pH 6.0 20x concentradoThermoFisher5000
Retractores ColibriF.S.T17000-04
Aplicadores con punta de algodónFisher scientific23-400-118
Citoqueratina 14 Anticuerpo monoclonalThermoFisherMA5-11599
Pinzas Dumont #5F.S.T11251-20
Pinzas Dumont #5/45F.S.T11251-35
Dumont #7 - Pinzas finasF.S.T11274-20
F4/80 Anticuerpo anti-ratón para ratasBio-Rad MCA497R
FicollSigma10831-100mL
Tijeras finas- Afiladas-romasF.S.T14028-10
Fisherbrand Premium Cover GlassesThermoFisher12-548-5M
Fluoroshield Medios de montaje con DAPIAbcamab104139
Anticuerpo secundario IgG anti ratón cabra Alexa Fluor 594ThermoFisherA-11001
Cabra anti conejo IgG Secundario Anticuerpo Alexa Fluor 594ThermoFisherA-11012
Cabra anti rata IgG Secundaria Anticuerpo Alexa Fluor 647ThermoFisherA-21247
IbuprofenoPrecision Dose, IncNDC 68094-494-59
Almohadillas de preparación de yodoDesechables profesionales international, Inc.NDC 10819-3883-1
Anticuerpo policlonal de queratina 5, BioLegend purificado905501
Inyección de clorhidrato de ketaminaHospira Inc.NDC 0409-2053
Pinza Micro-AdsonF.S.T11018-12
MicroscopioLeicaM80
Esponjas no tejidasCovidien441401
Pomada oftálmicaDechra Productos veterinariosNDC 17033-211-38
PBSGibco10010-023
PET/PU (Polietileno Tereftalato & Andamios de poliuretano)SolucionesPlaca
de PetriBD353003
RPMI 1640 MediumGibco11875-093
TISH Portaagujas/PinzasMicrinasMI1540
RecortadoraWahl9854-500
Vannas-Tü Tijeras de resorte bingenF.S.T15008-08
Recirculador de agua tibiaGaymarTP-700
Solución estéril de xilacinaAkorn salud animalNDC 59399-110-20
de nanofibras ordenada a medida

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proo....

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