Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

2.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/59174

⸱

29 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

En este artículo

Resumen

Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.

Resumen

La hepatitis autoinmune inducida por fármacos (DIH) es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente el 9 al 12% de los pacientes con hepatitis autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres. Los mecanismos subyacentes de estas diferencias de sexo en la prevalencia no están claros debido a la escasez de modelos animales que imitan la enfermedad humana. Aun así, se cree ampliamente que los mecanismos subyacentes están asociados con los haplotipos de antígenos leucocitarios humanos y las hormonas sexuales. En contraste, utilizando un modelo de ratón DIH, hemos descubierto que las células T CD4 + iniciadas por IL-4 dirigidas contra un epítopo del citocromo P450 2E1 inducen la afluencia de neutrófilos, macrófagos y mastocitos en los hígados de ratones hembra BALB / c. Usando este modelo, también hemos demostrado que las células T reguladoras FoxP3 + inducidas por IL-33 confieren protección contra DIH en ratones hembras y machos. Este modelo de DIH es inducido por la inmunización de ratones con un epítopo de CYP2E1 que ha sido alterado covalentemente con un metabolito del fármaco que se ha asociado con DIH. Este epítopo es reconocido por pacientes con DIH. Nuestro método induce hepatitis y autoanticuerpos robustos y reproducibles que se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de la DIH. Si bien los estudios in vivo pueden causar dolor y angustia indebidos en ratones cuando se realizan incorrectamente, la ventaja de un modelo in vivo es la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad en un gran número de ratones. Además, los efectos biológicos de las proteínas hepáticas alteradas se pueden estudiar mediante procedimientos invasivos. La adición de estudios in vitro al diseño experimental permite una rápida repetición y análisis mecanicista a nivel celular. Por lo tanto, demostraremos nuestro protocolo modelo y cómo se puede utilizar para estudiar los mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

Introducción

El propósito de este método es describir un modelo de ratón de hepatitis autoinmune inducida por fármacos que se desarrolla in vivo y demostrar cómo se puede utilizar para investigar las bases moleculares, inmunológicas y genéticas de esta enfermedad. El objetivo a largo plazo de nuestros estudios es descubrir mecanismos responsables del desarrollo de inflamación y lesión hepática crónica mediante el estudio de la DIH en pacientes susceptibles. La enfermedad hepática y la cirrosis constituyen la sexta causa más común de muerte en adultos entre las edades de 25 y 64 años. El DILI idiosincrásico, a veces denominado hepatitis autoinmune inducida por medicamentos (DIH, por sus siglas en inglés) es la tercera causa más común de insuficiencia hepática aguda en los Estados Unidos. DiH es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente 9 a 12% de los pacientes con hepatitis1 autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres 2,3,4. Un tipo de DIH se desarrolla en individuos susceptibles después de la administración de anestésicos volátiles halogenados como isoflurano, sevoflurano, desflurano o halotano. Estos anestésicos se unen covalentemente a las proteínas hepáticas con productos reactivos de su metabolismo, creando así nuevos autoantígenos capaces de provocar respuestas alérgicas o autoinmunes5.

El estudio de los mecanismos patógenos involucrados en el desarrollo de anestésicos y cualquier forma de DIH se ha visto obstaculizado previamente por la falta de un modelo animal que imite de cerca la inducción de la enfermedad humana. Hemos desarrollado un modelo murino experimental de DIH con características que se asemejan a DILI inmunomediado en pacientes. La hepatitis es inducida por la inmunización con uno de los dos autoantígenos que han sido modificados covalentemente por el metabolito cloruro de trifluoroacetilo (TFA) que se forma después del metabolismo oxidativo del anestésico por la enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantígeno es la fracción hepática citosólica S100 hepática, que es una mezcla de varias proteínas6, y el segundo autoantígeno es un epítopo de CYP2E1 que es reconocido por sueros de pacientes con DILI7 inmunomediado con anestesia. Mediante el uso de ratones BALB/c, que son relativamente resistentes a la hepatitis autoinmune experimental, distinguimos nuestro modelo del modelo de inmunización inducido por S100 de hepatitis autoinmune en ratones C57Bl/6J8.

Debido a sus diversas presentaciones clínicas, la DIH es difícil de estudiar en pacientes. Los modelos experimentales traslacionales ofrecen la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad in vivo e in vitro. En la actualidad, no existen otros métodos alternativos para inducir diH que examinen completamente las respuestas inmunes adaptativas o innatas in vivo o in vitro sin el uso de animales. Además, dado que la trifluoroacetilación de S-100 o del epítopo CYP2E1 no parece producir un inmunógeno irritante, y estamos induciendo DIH mediante la inmunización con proteínas alteradas por TFA, estos animales no recibirán éter, ningún anestésico halogenado, barbitúrico o alcohol antes de la inmunización u otros procedimientos, considerando que estos agentes pueden alterar los parámetros que estamos estudiando. Aun así, hemos disminuido nuestro uso de ratones mediante el uso de simulación por computadora para confirmar las preferencias de unión de nuestro epítopo CYP2E1descubierto 9 y hemos reflejado el DIH humano que implica el sexo femenino al demostrar que los ratones hembra BALB / c desarrollan un DIH10 más severo.

A pesar de las diversas presentaciones de DIH en pacientes y los desafíos en el estudio de la enfermedad clínica, la modificación post-traduccional de proteínas nativas por metabolitos reactivos de fármacos es un mecanismo clave aceptado en la patogénesis DIH que sigue a los anestésicos halogenados11. Los investigadores también aceptan que cyp2E1 es un autoantígeno importante en este proceso12,13. El papel de las células T CD4+reguladas por la interleucina (IL)-4-upregulated que reconocen un CYP2E1 modificado post-traduccionalmente y otras proteínas hepáticas es un iniciador aceptado de DIH anestésico al atraer neutrófilos, eosinófilos y mastocitos al hígado14, y este mecanismo se ha confirmado en muchas formas de DIH15,16. Las células T CD4+CD25+(Tregs) que expresan FoxP3 inducidas reducen la gravedad de la DIH, y las deficiencias relativas de estas células en el bazo empeoran la DIH 10,7. Por lo tanto, la mayoría de los avances en la comprensión de la DIH han sido posibles mediante la utilización de modelos de ratón in vivo para evaluar los mecanismos genéticos, metabólicos e inmunológicos de la DIH tanto in vivo como in vitro.

Debido a que nosotros y otros investigadores hemos descubierto roles para IL-4, neutrófilos y eosinófilos en el inicio de DIH utilizando diferentes modelos de ratón, creemos que esta observación apoya nuestra afirmación de que, independientemente del modelo DIH utilizado, la hepatitis y las lesiones son inducidas por IL-4. La fuerza de nuestro protocolo radica en la utilización de la metodología in vivo, tanto en ratones machos como hembras, y la repetición de histología, ensayos de proliferación de células T CD4+ y citoquinas. La fuerza de nuestro uso de estudios in vitro es que reducen el número de ratones necesarios al tiempo que proporcionan la metodología para aislar las interacciones celulares que impulsan la DIH. Recomendamos el uso de ratones machos y hembras porque esto reduce la posibilidad de sesgo inconsciente en la interpretación de los resultados y fortalece el potencial de traducción de nuestros estudios, ya que la incidencia, prevalencia y gravedad de la DIH es mayor en las mujeres17. Recomendamos que los ratones se obtengan de un solo proveedor; sin embargo, si esto no es posible, obtenga controles de pareja de camada o ratones de tipo salvaje del mismo proveedor que los ratones genéticamente alterados.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales.

1. Trifluoroacetilación de proteínas citosólicas hepáticas S-100 o un epítopo CYP2E1

NOTA: Primero, prepare el epítopo S100 trifluoroacetilado (TFA-S100) y el epítopo CYP2E1 trifluoroacetilado (TFA-JHDN5). Porque las proteínas S100 singénicas son necesarias para las inmunizaciones, y los ratones BALB / c son necesarios para producir el inmunógeno. La preparación produce una gran cantidad de inmunógeno; por lo tanto, anticipe realizar esta porción alrededor de cuatro veces al año. Se utilizará un método idéntico para hacer el TFA-JHDN5. El epítopo CYP2E1 (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, se puede secuenciar o comprar.

  1. Aislamiento de la fracción S100 del hígado.
    1. Después de la sedación de 5 – 10 ratones BALB/c con 40-60 mg/kg de ketamina mezclada con 4 – 6 mg/kg de xilazina, confirme la profundidad adecuada de la anestesia observando una reducción en el tono muscular y ninguna respuesta a estímulos dolorosos, como un pellizco en el dedo del pie (reflejo de abstinencia), además de la pérdida de reflejos de enderezamiento y la pérdida de reflejos palpebrales.
    2. Usando tijeras microquirúrgicas, exponga el contenido intraabdominal usando una incisión en la línea media y haga un pequeño corte en la vena cava inferior para extraer la sangre.
    3. Coloque un angiocatéter de calibre 24 en la vena porta y perfunda el hígado 10 ml / min con 40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4 en un baño de agua a 4 ° C. Retire y pese los hígados agrupados y córtelos en trozos pequeños (10 – 15 mm).
      NOTA: La eutanasia es inducida por inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxación cervical y apertura de la cavidad torácica para colapsar los pulmones. Este método proporciona el menor dolor e incomodidad a los animales. Este método es consistente con las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria.
    4. Añadir 4 veces el peso de sacarosa (250 mM) -TRIS (10 mM)- Tampón de homogeneización EDTA (1 mM) (pH 7.4) suplementado con comprimidos de cóctel inhibidor completo de proteasa (ver Tabla de materiales) según las recomendaciones del fabricante. Homogeneizar en un tubo de polipropileno de 15 ml, utilizando un homogeneizador general de tejido de laboratorio a velocidad media sobre hielo hasta que quede liso. Homogeneizar en hielo para evitar que el tejido se caliente durante la homogeneización.
    5. Centrifugar el hígado homogeneiza a 1500 x g durante 10 min y luego verter el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante durante 1 h a 100.000 x g. Congele el sobrenadante y guárdelo a -80 °C. El sobrenadante es S-100 citosólico.
  2. Trifluoroacetilación de S100 y JHDN5
    NOTA: La trifluoroacetilación de los grupos ε-amino de los residuos de lisina de S-100 se realizará de acuerdo con el procedimiento de Satoh18. Todas las partes de este experimento, con la excepción de los últimos días de diálisis, se realizan en la campana de humos.
    1. Determinar la concentración total de proteínas del S-100 citosólico mediante el ensayo de ácido bicinconínico (ensayo BCA)7. Diluir 20 mg de BALB/c ratón S100 o JHDN5 a 10 ml con dH2O en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Ajuste el pH a 10 con 1N KOH.
    2. Añadir 4,7 mmoles de S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA) a la solución. Mantener el pH entre 9.9 – 10.0 con 1N KOH administrando KOH en forma de gotas durante aproximadamente 1 h. Registre el volumen total de KOH para cada reacción.
    3. Transfiera las soluciones a casetes de diálisis separados (no llene en exceso). Dializar los casetes durante 72 h contra 4 L de dH2O con tres cambios por día. Después de la diálisis, registre el volumen final de TFA-S100 o TFA-JHDN5 y luego alícuota en tubos etiquetados. Congelar a presión y conservar a –80 °C.
    4. Una concentración estimada se determina dividiendo la cantidad inicial de S100 o JHDN5 (en mg) por el volumen final después de la diálisis (ml). Para determinar el porcentaje de modificación de la proteína nativa19, diluya 1.0 mg de cada proteína nativa y alterada por TFA (si la concentración final es mayor de 1.0 mg) a 1.0 mL con dH2O en tubos de bala separados y prepare un espacio en blanco usando 1.0 mL dH2O. Si la concentración de la proteína alterada por TFA es inferior a 1,0 mg, no diluya
      1. Para separar los pocillos de una placa de 96 pocillos, agregue 50 μL de las proteínas en blanco, nativas y alteradas. Añadir 50 μL de NaHCO3 al 4% seguido de 50 μL de ácido sulfónico 2,4,6-trinitrobenceno al 0,1% a cada pocillo.
      2. Incubar la placa a 40 °C durante 2 h. Después de la incubación, agregue 50 μL de SDS al 10 % a cada pozo seguido de 25 μL de 1N HCl.
      3. Lea a OD de 334 nm y luego registre la absorbancia de cada compuesto de 200 a 600 nm para confirmar la caída característica de la absorbancia a 334 nm. Calcule el porcentaje de modificación de residuos de lisina por TFA, utilizando la siguiente fórmula:
        figure-protocol-1

2. Inmunización de ratones para inducir hepatitis

NOTA: DIH se modela en ratones BALB/c mediante inmunizaciones con proteínas citosólicas hepáticas que han sido alteradas covalentemente por cloruro de trifluoracetilo (TFA), un metabolito fármaco modelo, TFA-S1006 o un epítopo de CYP2E1 alterado covalentemente por TFA9, TFA-JHDN5 que induce hepatitis, células T autorreactivas y autoanticuerpos CYP2E1. Los ratones exhiben una fase de activación esplénica 2 semanas después de la inmunización inicial y una fase hepática a las 3 semanas que se caracteriza por inflamación granulocítica. Los ratones hembra BALB/c son más susceptibles que los machos a la hepatitis en este modelo.

  1. El día 0, inmunizar a ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad por vía subcutánea en la base del cuello con 200 μg de TFA-S100 o 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados en volúmenes iguales de adyuvante completo de Freund (CFA). El día 0, inmunizar a los ratones con 50 ng de toxina tos ferina, por vía intramuscular en una de las patas traseras. El día 7, inmunizar a los ratones por vía subcutánea en la base de la cola con 200 μg de TFA-S100 o 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados en volúmenes iguales de CFA para garantizar que cada ratón reciba dos inyecciones del mismo inmunógeno.
    NOTA: Los ratones son monitoreados cada hora durante las primeras 6 horas después de la inmunización y luego al menos dos veces al día durante una semana. Si los ratones muestran signos de dolor o angustia, como postura encorvada o pelaje con volantes, se deben administrar analgésicos de acuerdo con el ACUC local. Si se observa dolor o angustia significativos, los ratones deben ser evaluados por un veterinario para determinar si la eutanasia es necesaria.
  2. Determinación de las respuestas inmunes de las células T CD4+ a autoproteínas enteras, epítopos de autoproteínas o al hapteno TFA mediante citometría de flujo
    1. Después de la sedación de ratones con 40-60 mg / kg de ketamina mezclada con 4-6 mg / kg de xilazina a través de inyección intraperitoneal, confirme la profundidad adecuada de la anestesia como se describe en el paso 1.1.1 y luego identifique el bazo después de exponer la cavidad intraabdominal con tijeras microquirúrgicas. Corte el bazo en el pedículo y colóquelo en una placa de Petri con PBS / 2% de suero fetal de la pantorrilla (FCS).
      NOTA: La eutanasia será inducida en los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxación cervical y apertura de la cavidad torácica para colapsar los pulmones. Este método proporciona el menor dolor e incomodidad a los animales. Este método es consistente con las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria.
    2. Suelte las células usando portaobjetos de vidrio esmerilado y transfiéralas a un tubo cónico de polipropileno de 50 ml. Lavar con PBS/2% FCS elevando el volumen hasta 50 ml y centrifugar a 335 x g utilizando una centrífuga refrigerada de sobremesa. Vierta el sobrenadante y repita este paso.
    3. Retire los glóbulos rojos usando 1 ml de tampón de lisado ACK durante 1 minuto y lleve el volumen hasta 50 ml con PBS / 2% FCS. Centrifugar a 335 x g y verter el sobrenadante.
    4. Cuente las celdas. Etiquete las células con CFSE durante 30 minutos en hielo en la oscuridad, según las instrucciones del fabricante. Suspender suspensiones unicelulares en placas de 6 pocillos de 3x106 celdas/ml por pozo en PBS/2% FCS.
    5. Estimular las células marcadas con CYP2E1, JHDN5 o TFA-OVA (10 μg/mL) durante 72 h a 37 °C en 5% de CO2, 95% de aire (humidificado). Después de la incubación, tiñe las células con CD4-APC (1:100) durante 30 min en hielo y analícelas por citometría de flujo dentro de los 3 días.
    6. Utilice la siguiente estrategia de cierre para identificar las células CD4 + CFSE +: Las células CD4 + CFSE + se identificarán a partir de las células vivas cerradas y se mostrarán como histogramas de células en proliferación.
  3. Aislamiento de células inmunes infiltrantes de ratones inmunizados.
    1. Para aislar las células inmunes infiltrantes en los hígados en el día 14 o el día 21, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal con 40-60 mg / kg de ketamina mezclada con 4-6 mg / kg de xilazina y confirmar la profundidad adecuada de la anestesia como se describe en el paso 1.1.1. Después de la laparotomía con una incisión en la línea media realizada con tijeras microquirúrgicas como se describe en 1.1.2, cannular la vena porta con una aguja de calibre 25 y luego cortar la vena cava inferior debajo de las venas renales.
    2. Perfundir cada hígado a un caudal de 10 mL/min con 40 mL de PBS en un baño de agua a 37 °C. Después de la perfusión, usando tijeras microquirúrgicas, corte el hígado en el pedículo hepático, extraiga la vesícula biliar y luego corte el hígado en el hilio.
    3. Interrumpa el hígado en un tamiz de malla de acero inoxidable utilizando un mortero de jeringa estéril de 20 ml y PBS frío. Filtre la suspensión celular resultante en tubos centrífugos preesterilizados de 50 ml utilizando una pantalla de malla de 300. Lleve cada suspensión a 50 ml usando PBS frío y luego lave la suspensión por centrifugación durante 10 minutos a 370 x g.
    4. Deseche el sobrenadante y luego agrupe cada pellet mediante tratamiento en nuevos tubos de 50 ml (se recomienda un tubo por ratón; sin embargo, si se agrupan muestras, se recomiendan 2-4 gránulos / tubo). Suspender los pellets agrupados en 45 mL Percoll 35% (en PBS), y 100 UI/ml de heparina.
    5. Girar cada tubo a 500 x g durante 10 min a 20 °C. Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet en 5 ml de PBS y luego agregue 1 ml de tampón de lisado ACK a cada gránulo durante 10 minutos en hielo.
    6. Llevar cada tubo a 50 ml con PBS y lavar por centrifugación durante 10 min a 370 x g. Deseche el sobrenadante y luego lave las células con PBS/2% FCS por centrifugación durante 10 min a 370 x g. Cuente las celdas.
    7. Análisis del tipo celular mediante citometría de flujo
      NOTA: Aquí hay un ejemplo de cómo se pueden detectar Foxp3 + Tregs inducidos.
      1. Incubar 1x106 células con reactivo bloqueador FcR y teñir con diluciones 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE y CD45-PerCP durante 30 min sobre hielo. A continuación, tiñe las células intracelularmente con FoxP3-APC.
      2. Fijar las células con 250 μL de tampón de fijación (ver Tabla de Materiales), y almacenar a 4 °C hasta el análisis por citometría de flujo dentro de los 3 días.
      3. Se recomienda la siguiente estrategia de cierre para detectar Foxp3 + Tregs inducidos en suspensiones de células individuales del hígado, bazo o ganglios linfáticos utilizando citometría de flujo: Identifique células vivas utilizando el kit de tinción de células muertas aqua reparables vivos / muertos. A continuación, la puerta en las células hepáticas que son CD45 + (PerCP, clon RA3-6B2) y la puerta cd4 + células (FITC, clonGK1.5) de la puerta CD45 +. A partir de las células CD4+, identifique los porcentajes de células CD25+ (PE, clon 7D4) y FoxP3+ (APC, clon 3G3).
  4. Análisis histológico de los tejidos hepáticos para la hepatitis
    1. El día 21, fije las secciones hepáticas (5 μm de espesor) en formalina tamponada neutra al 10% y manche con hematoxilina y eosina.
    2. Determine primero las puntuaciones de histología a baja potencia (40X) en un promedio de 2 vistas y confirme a 64X. Puntúe las secciones de tejido de la siguiente manera: Grado 0 = sin inflamación o necrosis; Grado 1 = inflamación lobulillar menor sin necrosis; Grado 2 = inflamación lobulillar que involucra <50% de la sección; Grado 3 = inflamación lobulillar que involucra ≥ 50% de la sección; y Grado 4=inflamación con necrosis.
  5. Determinación de los niveles de citoquinas tisulares en bazos e hígados.
    1. El día 14 o el día 21, homogeneice las muestras de hígado o bazo (1 g) de cada ratón en 1 ml de RPMI/2% FCS hasta que se suavice utilizando un homogeneizador general de laboratorio en un entorno medio. Mantenga la muestra fría sobre hielo.
    2. Centrifugar el homogeneizado durante 15 min a 1455 x g a 4 °C utilizando una centrífuga de escritorio refrigerada. Congele el sobrenadante y guárdelo a -80 °C hasta que esté listo para su uso. Los niveles de citoquinas y quimiocinas se pueden medir con kits ELISA comerciales, según las instrucciones del kit. Estandarizar los niveles de citoquinas convirtiendo los niveles (en mL o μL) en pg/g de tejido.
  6. Detección de anticuerpos séricos contra CYP2E1, el epítopo CYP2E1 JHDN5 y el metabolito del fármaco TFA.
    1. En los días 14 o 21, sedar a los ratones con 40-60 mg / kg de ketamina mezclada con 4-6 mg / kg de xilazina. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia observando una reducción en el tono muscular y ninguna respuesta a estímulos dolorosos, como un pellizco en el dedo del pie (reflejo de abstinencia), además de la pérdida de reflejos de enderezamiento y la pérdida de reflejos palpebrales. Utilice una aguja de 25 G conectada a una jeringa de tuberculina y acérquese al corazón haciendo avanzar lentamente la aguja hacia la cavidad torácica debajo de las costillas e inmediatamente lateral al proceso xifoide. Recolectar sangre mediante punción intracardíaca.
    2. Una vez que se recolecta la sangre, deje que se coagule a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras de sangre a 295 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado los sueros, alícuel los sueros y congele a -20 °C.
    3. Aplique 100 μL de antígenos de prueba CYP2E1, JHDN5 o TFA-ovoalbúmina (OVA) (5 μg/ml en PBS) a 96 placas de pocillos durante al menos 18 h a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, lave las placas con tampón de lavado (PBS / 2% FCS), 2 ciclos (4 lavados cada uno).
    4. Aplicar 100 μL de sueros de ratón (1:100) en PBS/2% FCS por triplicado en las placas e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Después de 2 h, lave las placas con tampón de lavado como se describe en el paso 2.6.2.
    5. Agregue 100 μL de fosfatasa alcalina (AKP)-cabra anti-ratón IgG, AKP-rata anti-ratón IgG1, o AKP-rata anti-rata IgG2a secundario (1:1000) durante 2 h seguido de un paso de lavado de 1 ciclo con tampón de lavado y 1 ciclo con PBS. Detecte los anticuerpos utilizando un kit de sustrato AKP y mida a OD 405 nm cada 15 min con un espectrofotómetro. El TFA generalmente se desarrolla completamente en 15 min, mientras que CYP2E1 y el epítopo CYP2E1 pueden desarrollarse de 30 a 60 min7.
  7. Estudios del desarrollo del estrés oxidativo inducido por IgG JHDN5 in vitro.
    1. Utilizando placas de 12 pocillos, incube 106 células hepáticas diferenciadas terminalmente por pozo en resbalones de cubierta cubiertos de fibronectina en 1000 μL de medios Williams E suplementados con glutamina y suplemento general (ver Tabla de Materiales) a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad durante 7 días según lo recomendado para maximizar la actividad de CYP2E1.
    2. Añadir JHDN5 IgG (1:40) o IgG de ratón (1:1000) para separar los pocillos e incubar durante 2 h a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad. Los sueros de hibridoma estaban muy diluidos. Agregue un detector de anticuerpos fluorescentes de color rojo intenso (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos adicionales a todos los pozos.
    3. Lave los pocillos 3 veces con 1 ml de PBS en la oscuridad. Fije las células en formaldehído al 3,7% durante 10 min. Examinar mediante microscopía confocal en 24 h.
  8. Estudios de colocalización de JHDN5 IgG con orgánulos intracelulares como las mitocondrias in vitro.
    1. Para demostrar la colocalización de JHDN5 IgG con mitocondrias, las células hepáticas diferenciadas terminalmente de cultivo escaso (~30%) en células hepáticas diferenciadas terminalmente en la cubierta cubierta de fibronectina se deslizan durante 7 días en medios E de Williams sin colorantes suplementados como se describe en el paso 2.7.
    2. Después de determinar las longitudes de onda de absorción correctas, agregue fluorescente verde, IgG o JHDN-5 de ratón conjugado de 488 nm (1: 100) y Fluorescente rojo, 594 conjugado Mito-tracker Rojo (1: 100) durante 2 h (37 ° C), 5% de CO2, 95% de humedad.
    3. Monte los resbalones de cubierta cubiertos de fibronectina etiquetados con reactivo antidesvanecimiento con DAPI y examine mediante microscopía confocal.

3. Notas del protocolo general

  1. Utilice herramientas de grado no farmacéutico cuando los compuestos no estén disponibles en una formulación de uso clínico. Sin embargo, obtenga cada una de estas herramientas de proveedores comerciales confiables identificados en este método. Siempre use productos químicos que se ajusten a las especificaciones definidas por el Comité de Reactivos Analíticos de la Sociedad Americana de Química de al menos el nivel de grado de reactivo. Para nuestros métodos, utilice reactivos analíticos a nivel de grado siempre que sea posible.
  2. Seguir una estricta técnica aséptica para la formulación de las proteínas alteradas por TFA con el fin de evitar la contaminación que podría afectar negativamente el bienestar animal o la interpretación de los datos.
  3. Almacene y use formulaciones de grado no farmacéutico a duraciones para las cuales la formulación seguirá siendo potente, según la información técnica disponible. Guarde CFA a temperatura ambiente, CYP2E1 y sus epítopos a -20 o -80 °C. Almacene las proteínas alteradas por TFA a -80 °C y deje que lleguen a 4 °C antes de la emulsificación con CFA. Almacene las proteínas alteradas por TFA a -80 °C y guárdelas en alícuotas para evitar que se repitan los ciclos de congelación-descongelación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El calendario de inmunización utilizado para inducir diH que se muestra en la Figura 1 representa las dos inmunizaciones requeridas en la base del cuello (día 0) y la base de la cola (día 7). La Figura 2 muestra datos representativos de proliferación obtenidos en el día 14 utilizando CFSE en respuesta a CYP2E1, JHDN5, el epítopo CYP2E1 y el metabolito trifluoroacetilo (TFA) de los anestésicos. La Figura 3 muestra la estrategia de ga...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La fuerza de este protocolo radica en su reproducibilidad; por lo tanto, es fundamental cumplir con los pasos sugeridos. La formulación del inmunógeno puede ser una barrera para algunos; sin embargo, hemos reproducido nuestro modelo utilizando el epítopo descrito en nuestro documento, que elimina la necesidad de aislar la fracción S100 del hígado. Es probable que se puedan alterar epítopos o proteínas adicionales e inducir hepatitis después de las inmunizaciones; sin embargo, describimos aquellas proteínas que hemos util...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El Dr. Njoku desea agradecer al Dr. Noel R. Rose, MD PhD, por su orientación y discusiones perspicaces que resultaron en la formulación de este modelo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,1% 2,4,6-trinitrobenceno ácido sulfónico (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Kit de sustratoBioRad172-1063
BALB/c ratonesJackson
CellTrace™ Kit de proliferación celular CFSEThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
FcR Reactivo bloqueanteMilteyi130-092-575
Suplemento generalThermoFisherHPRG770
HepaRG™ células criopreservadasThermoFisherHPR GC10
Vivo/Muerto Reparable Kit de tinción Aqua Dead Cell  ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Lista de toxinas para la tos ferinabiológicos180
Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4Varios
Pierce™ Inhibidor de la proteasa Mini comprimidos, sin EDTAThermoFisher88666
Hidróxido de potasioJT Baker3140-01
S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)Millipore Sigma 177474
Casetes de diálisis Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure™ Solución SDS, 10 %ThermoFisher24730020
Williams Media E, sin rojo fenolThermoFisherA1217601
Productos

Referencias

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Citocromo P450 2E1citometría de flujoperfusión hepáticaaislamiento de células esplénicastrifluoroacetilaciónprotocolo de inmunizaciónanálisis de hepatitisdiferencias sexuales
Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.