Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.
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Artículo de método
Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos
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Resumen
Resumen
La hepatitis autoinmune inducida por fármacos (DIH) es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente el 9 al 12% de los pacientes con hepatitis autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres. Los mecanismos subyacentes de estas diferencias de sexo en la prevalencia no están claros debido a la escasez de modelos animales que imitan la enfermedad humana. Aun así, se cree ampliamente que los mecanismos subyacentes están asociados con los haplotipos de antígenos leucocitarios humanos y las hormonas sexuales. En contraste, utilizando un modelo de ratón DIH, hemos descubierto que las células T CD4 + iniciadas por IL-4 dirigidas contra un epítopo del citocromo P450 2E1 inducen la afluencia de neutrófilos, macrófagos y mastocitos en los hígados de ratones hembra BALB / c. Usando este modelo, también hemos demostrado que las células T reguladoras FoxP3 + inducidas por IL-33 confieren protección contra DIH en ratones hembras y machos. Este modelo de DIH es inducido por la inmunización de ratones con un epítopo de CYP2E1 que ha sido alterado covalentemente con un metabolito del fármaco que se ha asociado con DIH. Este epítopo es reconocido por pacientes con DIH. Nuestro método induce hepatitis y autoanticuerpos robustos y reproducibles que se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de la DIH. Si bien los estudios in vivo pueden causar dolor y angustia indebidos en ratones cuando se realizan incorrectamente, la ventaja de un modelo in vivo es la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad en un gran número de ratones. Además, los efectos biológicos de las proteínas hepáticas alteradas se pueden estudiar mediante procedimientos invasivos. La adición de estudios in vitro al diseño experimental permite una rápida repetición y análisis mecanicista a nivel celular. Por lo tanto, demostraremos nuestro protocolo modelo y cómo se puede utilizar para estudiar los mecanismos in vivo e in vitro de DIH.
Introducción
El propósito de este método es describir un modelo de ratón de hepatitis autoinmune inducida por fármacos que se desarrolla in vivo y demostrar cómo se puede utilizar para investigar las bases moleculares, inmunológicas y genéticas de esta enfermedad. El objetivo a largo plazo de nuestros estudios es descubrir mecanismos responsables del desarrollo de inflamación y lesión hepática crónica mediante el estudio de la DIH en pacientes susceptibles. La enfermedad hepática y la cirrosis constituyen la sexta causa más común de muerte en adultos entre las edades de 25 y 64 años. El DILI idiosincrásico, a veces denominado hepatitis autoinmune inducida por medicamentos (DIH, po....
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de cuidado y uso de animales.
1. Trifluoroacetilación de proteínas citosólicas hepáticas S-100 o un epítopo CYP2E1
NOTA: Primero, prepare el epítopo S100 trifluoroacetilado (TFA-S100) y el epítopo CYP2E1 trifluoroacetilado (TFA-JHDN5). Porque las proteínas S100 singénicas son necesarias para las inmunizaciones, y los ratones BALB / c son necesarios para producir el inmunógeno. La preparación produce una gran cantidad de inmunógeno; por lo tanto, anticipe realizar esta porción alrededor de cuatro veces al año. Se utilizará un método idéntico para hacer el TFA-J....
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Resultados
El calendario de inmunización utilizado para inducir diH que se muestra en la Figura 1 representa las dos inmunizaciones requeridas en la base del cuello (día 0) y la base de la cola (día 7). La Figura 2 muestra datos representativos de proliferación obtenidos en el día 14 utilizando CFSE en respuesta a CYP2E1, JHDN5, el epítopo CYP2E1 y el metabolito trifluoroacetilo (TFA) de los anestésicos. La Figura 3 muestra la estrategia de ga.......
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Discusión
La fuerza de este protocolo radica en su reproducibilidad; por lo tanto, es fundamental cumplir con los pasos sugeridos. La formulación del inmunógeno puede ser una barrera para algunos; sin embargo, hemos reproducido nuestro modelo utilizando el epítopo descrito en nuestro documento, que elimina la necesidad de aislar la fracción S100 del hígado. Es probable que se puedan alterar epítopos o proteínas adicionales e inducir hepatitis después de las inmunizaciones; sin embargo, describimos aquellas proteínas que hemos util.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El Dr. Njoku desea agradecer al Dr. Noel R. Rose, MD PhD, por su orientación y discusiones perspicaces que resultaron en la formulación de este modelo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1% 2,4,6-trinitrobenceno ácido sulfónico (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Kit de sustrato | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c ratones | Jackson | ||
| CellTrace™ Kit de proliferación celular CFSE | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Reactivo bloqueante | Milteyi | 130-092-575 | |
| Suplemento general | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ células criopreservadas | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Vivo/Muerto Reparable Kit de tinción Aqua Dead Cell | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Lista de toxinas para la tos ferina | biológicos | 180 | |
| Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 | Varios | ||
| Pierce™ Inhibidor de la proteasa Mini comprimidos, sin EDTA | ThermoFisher | 88666 | |
| Hidróxido de potasio | JT Baker | 3140-01 | |
| S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA) | Millipore Sigma 177474 | ||
| Casetes de diálisis Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ Solución SDS, 10 % | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, sin rojo fenol | ThermoFisher | A1217601 |
Referencias
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S.
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Reimpresiones y permisos
