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Artículo de método

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

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DOI:

10.3791/59192

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11 de febrero de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de > 1.000 TFs en un solo experimento.

Resumen

Identificar los conjuntos de factores de transcripción (TFs) que regulan cada gen humano es una tarea de enormes proporciones que requiere la integración de numerosos enfoques experimentales y computacionales. Un tal método es el ensayo levadura uno híbrido (Y1H), en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de levadura usando genes del reportero. Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo., promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser examinado para la activación del gen reportero. Más publicados protocolos para realizar Y1H pantallas se basan en transformar cepas de levadura DNA-cebo TF-presa bibliotecas o arreglos de discos. Aquí, describimos un gasoducto, llamado Y1H mejorada (eY1H) de ensayos, donde las interacciones TF-DNA son interrogadas por el apareamiento de las cepas de ADN-cebo con una colección vestida de TF-presa cepas utilizando una matriz de alta densidad plataforma robótica (HDA) que permite la proyección en un 1.536 formato de la Colonia. Esto permite un aumento dramático en el rendimiento (60 secuencias de ADN-cebo contra > 1.000 TFs tarda dos semanas por el investigador) y reproducibilidad. Ilustran los diferentes tipos de resultados esperados analizando secuencias del promotor humano contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas, así como ejemplos de problemas que pueden surgir durante la pantallas y cómo solucionarlos problemas.

Introducción

Un problema central en el campo biomédico es determinar los mecanismos por el que se regula cada gene humano. La transcripción es el primer paso en el control de los niveles de expresión de genes, y es regulado por sistemas de factores de transcripción (TFs) que son únicos a cada gen. Dado que los seres humanos codifican para > 1.500 TFs1,2, identificar el conjunto completo de TFs que controlan la expresión de cada gen sigue siendo un desafío abierto.

Dos tipos de métodos se pueden utilizar para mapear las interacciones TF-DNA: métodos TF-centrado y centrado en la DNA3 (figura 1A). En métodos centrados en el TF, TF de interés es sondeado para atar regiones genómicas de ADN y determinar su especificidad de unión del ADN. Estos métodos incluyen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida por secuenciación de alto rendimiento, microarrays de la proteína vinculante y SELEX4,5,6. En los métodos centrados en el ADN, una secuencia de ADN de interés es sondada para determinar el conjunto de TFs que se unen a la secuencia de ADN. El más ampliamente aplicado de tales métodos es los ensayos (Y1H) levadura uno híbrido, en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de la levadura utilizando reporter genes7,8,9.

Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo, promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser evaluado para reportero gene activación9,10 (figura 1B). El cebo de ADN se clona río arriba del reportero dos genes (LacZ y HIS3) y ambos constructos de ADN-bait::reporter se integración en el genoma de la levadura para generar chromatinized 'cepas de ADN-bait'. TF-presa, codificada en un plásmido que expresa un TF fusionados con el dominio de activación (AD) de la levadura Gal4 TF, se introduce en la cepa de ADN-cebo para pescar las interacciones TF-DNA. Si la TF-presa se une a la secuencia de ADN-bait, el anuncio en la TF-presa dará lugar a la activación de ambos genes del reportero. Como resultado, las células con una interacción positiva pueden seleccionadas para el crecimiento en las placas que carecen de histidina, así como la superación de un inhibidor competitivo, de 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT) y visualizadas como colonias azules en presencia de X-gal. Porque el potente Gal4 de la levadura se utiliza AD, Y1H ensayos pueden detectar interacciones con activadores transcripcionales como represores. Además, dado que TF-presas se expresan de un promotor fuerte levadura (ADH1), las interacciones pueden ser detectadas incluso para TFs que tienen niveles de baja expresión endógena, que son difíciles de detectar por ChIP11,12.

Más publicados protocolos para la realización de ensayos de Y1H se basan en introducir TF-presas en el cebo de ADN de levaduras transformando agrupadas bibliotecas TF-presa seguidas por la selección, Colonia selección y secuenciación para identificar la interacción TF, o por transformación de los clones de8,9. Estos son protocolos de tiempo, limitando el número de secuencias de ADN que puede ser probado por el investigador. Una reciente mejora de Y1H ensayos, llamado enhanced Y1H (eY1H), ha aumentado espectacularmente el rendimiento del cribado mediante el uso de una plataforma robótica de alta densidad matriz (HDA) para cepas de levadura DNA-cebo con una colección de cepas de levadura cada uno expresando diferentes TF-presa10,13 (figura 1). Estas pantallas emplean un formato 1.536 Colonia que permite probar TFs más humanas por cuadruplicado, usando solamente tres platos. Además, dado que las interacciones de la TF-ADN se prueban en forma pares, este enfoque permite comparar las interacciones entre DNA-cebos (como dos variantes de los nucleótidos) y entre diferentes TFs o TF variantes11,12 ,14.

Usando análisis de eY1H, hemos delineado el humano más grande y elegans de Caenorhabditis TF centrada en el ADN-ADN interacciones redes hasta la fecha. En particular, hemos identificado 2.230 interacciones entre 246 potenciadores del desarrollo humanos y de TFs 28312. Además, hemos empleado eY1H ensayos para descubrir la alteración Unión TF 109 variantes de cubierta un solo nucleótido asociados con enfermedades genéticas tales como malformación del desarrollo, cáncer y trastornos neurológicos. Más recientemente, utilizamos eY1H para delinear una red compuesta por 21.714 interacciones entre 2.576 promotores de genes de C. elegans y 366 TFs11. Esta red fue clave para descubrir el papel funcional de docenas de TFs de C. elegans .

Los protocolos para generar manchas de ADN-bait y evaluar los niveles de actividad de reportero de fondo han sido divulgado a otra parte15,16,17. Aquí, describimos un gasoducto eY1H que puede utilizarse para cualquier región de ADN genómico humano contra una amplia gama de 1.086 TFs humanas. Una vez que se genera una levadura cepa de ADN-cebo y una matriz de TF-presa es descubierta en las placas correspondientes, el conjunto del Protocolo puede realizarse en dos semanas (cuadro 1). Lo más importante, el protocolo puede ser paralela para que un investigador solo puede pantalla 60 secuencias de ADN-cebo. Para demostrar el protocolo, defendimos a los promotores de los dos genes de citoquinas CCL15 y IL17F. Además, mostramos resultados de fallido pantallas para ilustrar los tipos de problemas que pueden surgir al realizar ensayos de eY1H y cómo solucionarlos problemas.

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Protocolo

1. preparaciones

  1. Placas SC −U −H (platos de Petri de 150 mm)
    Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo de las cepas de levadura DNA-cebo.
    1. Disolver la mezcla de abandono, levadura nitrógeno base (YNB), hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de media; ver tabla 2 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C en un baño de agua.
    5. Añadir la leucina y el triptófano a los medios de comunicación. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en los platos de Petri estériles de 150 mm (~ 80 mL por plato). Seco de 3 a 5 días a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses.
  2. Placas rectangulares de YAPD
    Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo del césped para la cepa de ADN-cebo y para acoplarse con la colección de la matriz TF.
    1. Disolver los polvos (ver tabla 3 para la composición), excepto el agar, en 950 mL de agua en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco.
    5. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C. Vierta los medios de comunicación en las placas rectangulares (ver Tabla de materiales; ~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 6 meses.
      Nota: Aunque el volumen de los medios sugeridos es 70 mL por placa, puede utilizarse 50 – 80 mL por placa. Los tres temas críticos a considerar cuando las placas de colada son 1) que son nivelados para que los medios de agar tienen el mismo espesor en toda la placa (uso una mesa nivelada o superficie para verter la placa y no vierta en pilas de más de siete placas) 2) para asegurar la ausencia de burbujas en el agar media (burbujas deben hacer estallar usando una aguja estéril) y 3) las placas de sequía durante sólo un día y envolviendo las placas en bolsas de plástico para evitar fallos en la fijación de levadura.
  3. −Trp SC y Sc −U −Trp placas rectangulares
    Nota: Estas placas se utilizará para el crecimiento de la colección de la matriz TF (Sc −Trp) y seleccionar levadura diploide después de aparearse (Sc −U −Trp).
    1. Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con NaOH 5M (aproximadamente 1 mL por litro de media) (ver tabla 4 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.
    5. Añadir la leucina, histidina y uracilo (omitir el uracilo para las placas de −Trp Sc −U).
    6. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y tubo de 6 mm. Secar por 1 día a temperatura ambiente, envuelva las placas en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 3 meses.
  4. SC −U −H −Trp 3Por + placas rectangulares X-gal
    Nota:     estas placas se utilizará como placas de lectura para los ensayos de eY1H.
    1. Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 850 mL de agua (véase la tabla 5 para la composición). No no pH. Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.
    2. En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 850 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).
    3. Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.
    4. Preparar 10 x sales BU (1L) mediante la combinación de 900 mL de agua, 70 g de Na2HPO4∙7H2O y 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. mezcla utilizando una barra de agitación para disolver polvos y ajustar el pH a 7.0 con NaOH M 5. Añadir agua para llevar a 1 L y autoclave.
    5. Preparar la solución de X-gal agregando 3,5 g de polvo de X-gal a un tubo de plástico de 50 mL que contiene 42,5 mL de formamida dimethyl. Añadir polvo de X-gal a dimetil formamida para disolver más fácilmente (esto tarda 30 min). Mantener la solución en la oscuridad (uso opaco 50 ml tubo o cubierta en papel de aluminio). Almacenar a-20 ° C.
    6. Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa y el 10 x BU sales (véase la tabla 5 para la composición), mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.
    7. Añadir la leucina, 3AT y X-gal (véase la tabla 5 para la composición).
    8. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en las placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío cubierto de papel de aluminio (3Por y X-gal son sensibles a la luz) durante 1 mes.

2. observación de una variedad TF

  1. Descongelar la matriz TF-presa
    1. Descongelar la chapa levadura glicerol con la gama TF-presa sobre el hielo.
      Nota: TF-presa matrices pueden generarse previamente publicados10,12,13,18.
    2. Suspender la levadura con una pipeta 12 canales dentro de 1 a 3 minutos antes del siguiente paso.
  2. Manchar la levadura en −Trp Sc placas rectangulares
    1. En el robot de HDA (véase Tabla de materiales), seleccione múltiples bien 96 placas como fuente, 96 placas de agar como blanco y cojines pin largo 96.
      Nota: PIN pads no son reutilizables y deben ser desechados.
    2. Seleccione el programa Replicar muchas para hacer dos copias por placa de 96 pocillos. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la posterior contaminación de las reservas congeladas.
    3. Seleccione la opción de remolino hacia arriba y hacia abajo en la fuente para mezclar la levadura.
    4. La bolsa la matriz manchada e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días.
  3. Generación de matrices de Colonia 384 en placas rectangulares de Sc −Trp
    1. En el robot, seleccione 96 placas de agar como fuente, placa de agar 384 como destino y 96 pastillas pasador corto.
    2. Seleccione el programa de la matriz 1:4 . De esta manera, placas cuatro 96 Colonia (cada uno con un TF diferentes) se consolidará en la placa de una 384 Colonia. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la contaminación entre diferentes placas.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 384-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 2 días.
  4. Generar matrices de Colonia 1.536 en placas rectangulares de Sc −Trp
    Nota: Esto resultará en arreglos de discos que contiene cuatro colonias para cada presa de TF.
    1. En el robot, seleccione 384 placas de agar como fuente, las placas de 1.536 agar como blanco y cojines pasador corto 384.
    2. Seleccione el programa de fuente de análisis de 1:4. El objetivo es copiar cada colonia en cuatro colonias para obtener quadruplicates. Utilizar el reciclaje y revisar opciones de como se trata de copiar cuatro veces cada colonia.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días.
  5. Amplificando la matriz 1.536 Colonia en placas rectangulares de Sc −Trp
    1. En el robot, seleccione 1.536 placas de agar como fuente, 1.536 placas de agar como destino y 1.536 cojines pasador corto.
    2. Seleccione el programa Replicar muchas replicar copias de 3 – 4. Utilizar el reciclaje y revisar opción pero lanzar la almohadilla cuando se cambia a un plato diferente de la matriz para evitar la contaminación cruzada.
    3. La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días para apareamiento pasos (véase abajo). Después de eso, mantener las placas a temperatura ambiente y copia otra vez después de 7 días para una nueva ronda de cribado.

3. eY1H pantalla

  1. Preparación de céspedes de cepa de ADN-cebo para el apareamiento
    1. Spot la levadura cepas de ADN-cebo en una placa de Sc −U −H y crecer durante 3 días a 30 ° C.
    2. Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato adapta a diferentes cepas de 12 – 16. Incubar un día a 30 ° C.
    3. Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato ajusta a 4 diferentes cepas. Incubar durante un día a 30 ° C.
    4. Raspar la levadura usando un palillo de dientes estéril, asegurándose de no raspar cualquier agar y añadir en un tubo de 1,5 con 500 μl de agua estéril.
    5. Agregar perlas de vidrio estériles de 10 – 15 en una placa rectangular de YAPD. Añadir la suspensión de levadura sobre la placa y agitar bien en todas las direcciones durante 1 min para que la levadura se propaga a través de la placa.
    6. Invertir la placa inmediatamente y aprovechar para que los granos van a la tapa. Eliminar y reciclar los granos.
    7. Bolsa de las placas e incubar agar hacia abajo durante 1 – 2 días a 30 ° C. Luego proceder a la etapa de apareamiento.
  2. Apareamiento de levadura DNA-bait y cepas de variedad TF
    1. Transferencia de la matriz TF a una placa rectangular de YAPD con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Cada placa de matriz TF puede utilizarse para transferir a las placas YAPD de 3 a 4 (dependiendo del número de placas en la matriz). Las placas de matriz TF utilizadas para el apareamiento deben ser 2 o 3 días pero no más como apareamiento pueden ser ineficiente.
    2. Transferir el césped de una cepa de ADN-cebo a las placas YAPD ya que contiene la matriz TF con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Utilizar un desplazamiento aleatorio en la fuente con un radio de ~0.6 m para evitar tomar levadura desde el mismo lugar y mezclar en el objetivo de facilitar el contacto entre las cepas de levadura. Utilizar el césped que contienen las cepas de ADN-cebo (sección 3.1) como fuente y las placas YAPD que contiene la matriz TF en paso 3.2.1 como destino.
    3. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C por 1 día.
  3. Selección de la levadura diploide
    1. Transferir la levadura acoplada de las placas YAPD placas de −Trp Sc −U con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar . Mezclar en origen y en destino.
    2. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días (incubación más largo conduce a actividad de reportero de fondo alta).
  4. Transferencia a las placas de la lectura
    1. Transferir la levadura diploide de las placas de −Trp Sc −U lectura placas rectangulares Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal con el robot. Seleccione las placas de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar .
    2. La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C hasta por 7 días.
  5. Proyección de imagen de las placas de la lectura
    1. ADN-cebo de cepas con actividad de reportero de fondo alta, tomar fotos en los días 2, 3 y 4. De lo contrario, tomar fotos a los 4 y 7 días. Interacciones positivas se identifican por el color azul y el crecimiento de las colonias de levaduras y se pueden determinar manualmente, o puede ser determinado mediante software de análisis de imagen.

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Resultados

Tres factores deben considerarse al analizar resultados de pruebas de eY1H: la actividad de reportero de fondo de la cepa de ADN-bait, la fuerza de la actividad de periodista correspondiente a las interacciones TF-DNA y el número de colonias positivas. La actividad del reportero de fondo (es decir, autoactivity) de la cepa de ADN-cebo se refiere al crecimiento y al color de las colonias de levaduras en la placa de la lectura, incluso en la ausencia de un TF-presa general. Lo ideal sería no autoactive cepas muestran un fo...

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Discusión

Robótica eY1H acoplamiento proyección lo descrito aquí enormemente aumenta el rendimiento para identificar el conjunto de TFs que se unen a una región de ADN de interés, en comparación con la anterior proyección de biblioteca o proyección vestida enfoques basados en transformación. Además, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H ensayos son altamente reproducibles como el 90% de las interacciones detectadas positivas para todas las cuatro colonias probados por TF, y 90% de las interacciones vuelva a probar en ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC SigmaA8056-100GInhibidor competitivo para productos del gen HIS3
Sulfato de adenina (hemisulfateo), dihidratoUS BiologicalsA0865Necesario para el crecimiento adecuado
la levadura Agar Alta fuerza de gel - Grado bacteriológicoAmerican International ChemicalAGHGUPMedios nutritivos para el crecimiento de levaduras
Sulfato de amonioUS BiologicalsA1450Fuente de nitrógeno en medios de levadura sintética
D+ Glucosa anhidraUS BiologicalsG3050Necesario para el crecimiento
Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp y Uracil, rico en adenina sin base de nitrógenoUS BiologicalsD9540-02Medios sintéticos completos necesarios para el borde de crecimiento de la levadura
Medidor de pH multiparamétricoHanna InstrumentsHI2020-01Para medir el pH de medios selectivos
Palillos de dientes planos 750 ctDiamantePara rayar levaduras en placas de Petri
Cuentas de vidrioWalter Stern100CPara esparcir levadura al hacer césped
Glicerol ≥ 99%Millipore SigmaG9012-1LNecesario para hacer caldos de levadura congelados
L-HistidinaUS BiologicalsH5100Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
L-LeucinaUS BiologicalsL2020-05Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
L-TriptófanoSigma T-0254Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
N, N-dimetilformamidaSigma319937-1LPara hacer la solución X-gal
Omnipense EliteWheatonW375030-APara dispensar volúmenes precisos de medios en placas Singer
Peptona, BacteriológicaAmerican International ChemicalPEBAUPFuente de proteína necesaria para el crecimiento de la levadura
Placa de Petri, 150 mm x15 mmVWR10753-950Para el cultivo de cebos de levadura para cribado
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003Para hacer placas rectangulares de agar para usar con Singer Robot
Precision Incubadora refrigerada de DBO de baja temperaturaThermoFisher ScientificPR205745RPara incubar placas de levadura a temperatura constante
RePads 1.536 cortosSinger InstrumentsREP-005Para transferir la matriz TF-presa, aparear la levadura y transferir la levadura a las placas de selección y lectura de diploides
RePads 384 cortoSinger InstrumentsREP-004Para transferir el array TF-prey de 384 a 1.536 en formato de colonia
RePads 96 largoSinger InstrumentsREP-001Para transferir el array TF-prey del caldo de glicerol a la placa de agar
RePads 96 shortSinger InstrumentsREP-002Para transferir la matriz TF-prey de 96 a 384 colonias en formato
Singer HDA Robot RoToRSinger InstrumentsPara transferir levadura de alto rendimiento
Hidróxido de sodio (pellets/ACS certificado)FisherS318-1Para ajustar el pH de medios selectivos
Fosfato de sodio dibásico heptahidratadoSanta Cruz Biotechnologysc-203402CRequerido para la actividad reportera de LacZ en X-gal 
Fosfato de sodio monobásico monohidratadoSanta Cruz Biotechnologysc-202342BRequerido para la actividad del reportero LacZ en X-gal 
UracilSigmaU0750-100GPara la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos
X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopiranósido)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidasa se vuelve incolora X-gal azul para detectar la interacción proteína-ADN
Extracto de levadura USBiologicalsY2010Medio nutritivo para el crecimiento y la propagación de la levadura
Base de nitrógeno de levadura (polvo) sin AA, carbohidratos y sin AS US BiologicalsY2030Necesario para un crecimiento vigoroso de la levadura
de de la levadura de levadura

Referencias

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50(2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

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