Artículo de método

Puntos finales importantes y marcadores proliferativos para evaluar lesiones intestinales pequeñas y adaptación utilizando un modelo de ratón de mucositis inducida por quimioterapia

DOI:

10.3791/59236

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12 de mayo de 2019

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1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para establecer puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeña lesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular y utilizando el peso intestinal pequeño, la profundidad de la cripta y la altura de las vellosidades como puntos finales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural que se produce cuando el intestino se pierde debido a un trauma. Las respuestas adaptativas, como la proliferación de células de cripta y el aumento de la absorción de nutrientes, son fundamentales en la recuperación, pero mal entendidas. Comprender el mecanismo molecular detrás de las respuestas adaptativas es crucial para facilitar la identificación de nutrientes o fármacos para mejorar la adaptación. A lo largo de la literatura se han descrito diferentes enfoques y modelos, pero se necesita una forma descriptiva detallada de realizar esencialmente los procedimientos para obtener datos reproducibles. Aquí, describimos un método para estimar puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeñalesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia en ratones. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular, así como el uso de peso intestinal pequeño, profundidad de la cripta y altura de vellosidad como puntos finales. Algunos de los pasos críticos dentro del método descrito son la extracción y el pesaje del intestino delgado y el sistema de software bastante complejo sugerido para la medición de esta técnica. Estos métodos tienen las ventajas de que no consumen mucho tiempo y que son rentables y fáciles de llevar a cabo y medir.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural quese produce cuando el intestino se pierde debido a una enfermedad o cirugía 1,2. Después del trauma, el intestino se somete a una respuesta adaptativamorfométrica y funcional, caracterizada por la proliferación celular de la cripta y el aumento de la absorción de nutrientes 3. Este paso es fundamental en la recuperación, pero mal entendido. Los estudios experimentales de la respuesta adaptativa intestinal se han centrado en los cambios que se producen después de la resección del intestino delgado en ratones, ratas y cerdos, pero la comprensión del mecanismo molecular detrás de la respuesta adaptativa en otros tipos de lesiones (por ejemplo, química o bacteriano) es crucial para facilitar la identificación de nutrientes o medicamentos para mejorar la adaptación. Experimentalmente, se han utilizado diferentes enfoques para describir el complejo índice molecular y celular de la pequeña patología intestinal, incluyendo la puntuación histopatológica y la medición del resultado de la lesión. A pesar de esto, lo que está ausente de la literatura es una descripción detallada de cómo realizar los procedimientos que se necesitan para obtener datos reproducibles. Al identificar los factores involucrados en la adaptación, como las hormonas intestinales, se justifica un modelo animal fácil, de bajo costo y reproducible, y aquí sugerimos usar un modelo de mucositis intestinal inducida por quimioterapia (CIM).

Uno de los puntos finales más simples y muy informativos tanto de lesión como de adaptación es medir la masa del intestino delgado (SI). Sabemos que un sello distintivo de la mucositis es la apoptosis de los enterocitos, la atrofia de vellosidades dependiente del tiempo y la reducción de la mitosis. Por lo tanto, el examen de lamorfología intestinal es muy relevante en los modelos preclínicos 4,5. En los seres humanos, una disminución de la citrulina plasmática, un marcador de enterocitos en funcionamiento, se correlaciona con las puntuaciones de toxicidad y los marcadores inflamatorios6 además de la capacidad de absorción7, lo que sugiere que este aminoácido es un excelente biomarcador de Mucositis. La citrulina se puede medir tanto en ratones comoen ratas, y ha demostrado excelentes correlaciones con la longitud de vellosidades 8, la supervivencia de la cripta9y la mucositis inducida por radiación10.

Una de las principales ventajas de medir la citrulina plasmática es la capacidad de recoger mediciones repetidas de un animal. Sin embargo, el muestreo de sangre múltiple en ratones está restringido a un volumen total de sangre de 6 l/g/semana y requiere anestesia general. Esto por desgracia también limita el uso de mediciones de citrulina en ratones. Además, la medición de la citrulina requiere cromatografía líquida de alto rendimiento11,12, que es costosa y requiere mucho tiempo. Recientemente, mostramos que los niveles de citrulina en ratones se correlacionan significativamente con el peso de SI (p < 0.001) (datos no publicados), haciendo de la citrulina una medida directa que refleja la masa de enterocitos. Una limitación a la medición del peso SI es la necesidad de sacrificar los ratones y, por lo tanto, no es posible realizar mediciones repetidas dentro del mismo ratón. Aun así, el método ofrece la posibilidad de realizar una variedad de otros análisis de tejidodirigidos a la pregunta de investigación, y estos hechos pueden compensar el uso adicional de animales. Por lo tanto, sugerimos el uso del peso SI como un biomarcador fácil, de bajo costo y rápido de lesiones y adaptación en ratones. Para garantizar la reproducibilidad y la variación analítica aceptable, los intestinos deben ser cuidadosamente retirados del animal, lavados con salina, vaciados y secados antes de pesar. En este artículo, mostramos exactamente cómo se realiza este procedimiento.

Otro sello distintivo de la mucositis es la pérdida de las células proliferantesen las criptas y una hiperproliferación compensatoria durante el período regenerativo 3. El marcador celular Ki67 se ha utilizado con frecuencia para determinar células proliferativas rápidas por medio de inmunohistoquímica13. A pesar de que Ki67 es un simple marcador de proliferación, tiene una tendencia a la imprecisión ya que Ki67 está presente durante todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y M)14. El etiquetado específico es esencial para detectar células replicantes, por lo que sugerimos la incorporación in situ de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), un análogo sintético de la timidina, ya que se limita en gran medida a la replicación de células en la fase S15. BrdU se inyecta en los animales 150 minutos antes del sacrificio y las células se pueden detectar posteriormente con inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos de BrdU. En este artículo de método, mostramos exactamente cómo medir el área de las células inmunopositivas De dUu dentro de una cripta utilizando un software de imagen libre.

Los cambios morfológicos y funcionales a menudo se estudian en modelos de mucositis inducida por 5-FU, donde la adaptación intestinal se evalúa por altura de vellosidad y profundidad de la cripta. Durante este estudio, encontramos que durante la fase aguda de la mucositis, que es igual a la fase de lesión, la proliferación medida por la incorporación de BrdU no está correlacionada con la profundidad de la cripta. En contraste con esto, la profundidad de la cripta se correlaciona significativamente con la proliferación vista en la fase de reparación de la mucositis, 3 a 5 días después de la inducción. Esto sugiere que la fase aguda de la mucositis no se puede medir solo por la profundidad de la cripta. Sugerimos que cuando se utiliza la proliferación como punto final en la fase aguda de los ratones de mucositis, la incorporación de BrdU debe utilizarse preferentemente, pero al cuantificar la hiperproliferación en la etapa posterior durante la fase regenerativa, la profundidad de la cripta es una profundidad razonable alternativa a la incorporación de BrdU. El objetivo de este estudio fue describir este modelo de una manera que pueda ser utilizado por todos los investigadores, tanto en el campo de la oncología, pero especialmente los investigadores no familiarizados con los modelos de lesión intestinal.

El modelo descrito se puede utilizar para fenotipo modelos transgénicos de acuerdo con la respuesta adaptativa utilizando el peso corporal, el peso SI y la profundidad de la cripta como puntos finales. Como ejemplo, mostramos aquí cómo usamos el modelo de mucositis inducida por 5-fluorouracilo (5-FU) en un modelo celular knock out con secreción insuficiente de células L16. El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y el péptido similar al glucagón-2 (GLP-2) son hormonas intestinales cosecretadas de las células L enteroendocrinas en respuesta a la ingesta de alimentos17,18. GLP-2 es reconocido como un factor importante para la curación intestinal, la regulación de la apoptosis mucosa y la mejora de la función barrera del SI19,20,21,22. Basándonos en la literatura, hipotetizómos que las hormonas endógenas son esenciales para la hiperproliferación compensatoria que ocurre en la respuesta adaptativa después de una lesión.

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Protocolo

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Todos los métodos descritos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Los estudios se realizaron con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos Animales (2013-15-2934-00833) y del comité ético local.

NOTA: Los ratones hembra C57BL/6J (20 a 25 g) se obtuvieron y albergaron ocho por jaula en luz estándar de 12 h, ciclo oscuro de 12 h con acceso gratuito al agua y comida estándar. Los animales fueron dejados para aclimatarse durante una semana antes de que comenzaran los experimentos.

1. Inducción de la mucositis con 5-fluorouracilo

  1. Obtener 5-fluorouracilo (5-FU) en una solución de 50 mg/ml.
  2. Pesar y registrar el peso corporal de los ratones. A partir del peso corporal, calcule la cantidad de 5-FU inyectable (por ejemplo, 400 mg/kg).
  3. Prepare una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 27 G x 30 mm y llene la jeringa con la cantidad calculada de 5 FU para inyección.
  4. Restringir el ratón por el método scruff. Para ello, agarre la base de la cola con una mano y colóquela sobre una superficie de agarre del dedo del pie, como una tapa de la barra de alambre. Mientras coloca la cola con una mano, sostenga el escruff del cuello con la otra mano.
  5. Coloque firmemente el cuerpo del ratón a través de una mano extendiendo el dedo índice y el pulgar hacia atrás en la medida de lo posible. Coloque la cola entre los dedos de esta misma mano para asegurar el ratón.
  6. Mientras mantiene el ratón en un agarre firme pero suave, exponga el lado ventral del ratón e inserte la aguja en la cavidad intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen. Aspirar para asegurar una colocación adecuada e inyectar el 400 mg/kg 5-FU.

2. Recolección de tejidos

  1. Anestetizar el ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100/10 mg/kg) diluida en solución salina (0,9% NaCl). Controle la profundidad de la anestesia observando el reflejo de abstinencia de pellizcar.
    NOTA: La anestesia es una anestesia sin recuperación.
  2. Registre el peso del ratón anestesiado.
  3. Coloque el ratón en posición supina y realice una laparotomía para exponer la cavidad abdominal, seguida de una incisión de la cavidad torácica para introducir neumotórax.
  4. Con tijeras, sacrifica al animal cortando el diafragma.
  5. Retire el intestino delgado. Cortar superior al píloro, retirar cuidadosamente el intestino delgado lejos de la canal hasta que se alcanza el cecum y hacer un corte justo antes del cecum.
  6. Con fórceps, cierre suavemente el lumen proximal. Con una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G unida, enjuague el intestino delgado con salina para extraer las heces.
  7. Retire suavemente la salina del lumen intestinal con instrumentos quirúrgicos.
  8. Coloque el intestino delgado sobre papel de hincha limpia para eliminar cuidadosamente el exceso de salina.
  9. Registre el peso del tejido enjuagado.
  10. Calcular el peso intestinal pequeño lavado como un porcentaje de peso corporal.

3. Histología del intestino delgado

  1. Preparación de tejidos
    1. En una campana de humos, utilice tijeras para cortar secciones de 3 cm del tejido intestinal lavado de cada ratón del duodeno, yunú y el íleon y las secciones de fijación en secciones de 10% de formalina durante 24 horas a temperatura ambiente.
      NOTA: El volumen fijador debe ser de 5 a 10 veces el volumen de tejido.
    2. Transfiera el tejido fijo a una tabla de cortar.
    3. Con un bisturí, recorta el tejido a aproximadamente 1 cm y transfiéralo a un casete incorporado.
      NOTA: El cassette debe estar etiquetado con la identificación de la muestra (ID) a lápiz.
    4. Sumerja el cassette en 70% de etanol y guárdelo a 4oC hasta su posterior procesamiento.
  2. Inserción de tejido en parafina
    1. Deshidratar el tejido mediante la colocación de soluciones de alcohol ascendentes. Colocar el cassette en etanol al 70% durante 1 h, seguido de 80% de etanol para 1 h, 95% etanol para 1 h y 100% etanol para 1,5 h. Transfiera el cassette de 100% de etanol a xileno durante 1,5 h.
    2. Sumerja el cassette con cera de parafina calentada entre 58 o 60 oC. Utilice fórceps para colocar el tejido en una orientación transversal y deje que los bloques se enfríen más de 24 horas hasta que estén sólidos.
  3. Cortar tejido con un microtome
    1. Colocar el bloque, el tejido boca abajo en el hielo durante 5 minutos Con un microtome, recortar los bloques de parafina a un espesor de 10 a 30 m para exponer la superficie del tejido.
    2. Corte las secciones transversales del bloque tisular entre 3 x 5 m, haciendo secciones transversales del duodeno, el yeyuno y el íleon.
    3. Coloque la cinta de parafina en un baño de agua entre 40 o 45 oC. Utilice fórceps para separar las secciones.
    4. Utilice portaobjetos de microscopio para recoger las secciones del agua.
    5. Seque al aire los portaobjetos durante 30 minutos antes de mancharlos.
      NOTA: Para el almacenamiento durante un período de tiempo más largo, guarde los portaobjetos en un refrigerador.
  4. Tinción de hematoxilina-eosina del tejido
    1. Coloque las diapositivas del microscopio en una cuna de histología. Desparaffinizar los portaobjetos en un armario de calefacción a 60 oC durante 60 min.
      NOTA: Se deben dejar diapositivas directamente desde el frigorífico para alcanzar la temperatura ambiente antes de colocarlos en un armario de calefacción.
    2. En la campana de humos, rehidratar el tejido en 3 cambios de un agente de limpieza (Tabla de materiales), hacer 20 caídas en el primer frasco de agente de limpieza y luego dejarlos reposar durante 7 x 8 minutos en cada uno de los dos frascos de agente de limpieza adicionales. Transfiera los toboganes a soluciones de alcohol descendentes, comience con 3 cambios de etanol al 99%, seguido de 2 cambios de 96% de etanol y 70% de etanol. Haga un mínimo de 20 inmersiones en cada frasco. Transfiera al agua corriente y deje reposar los portaobjetos durante 5 minutos.
    3. Sumerja las diapositivas en la hematoxilina filtrada de Meyer durante 1 min.
    4. Lave las muestras con agua corriente del grifo durante 5 min.
    5. Sumerja las secciones en la mancha de eosina durante 1 x 2 minutos y, a continuación, enjuague en agua del grifo.
    6. Deshidratar el tejido mediante la colocación de soluciones de alcohol ascendentes. Comience con 70% de etanol, seguido de 96% de etanol, 96% etanol y 4 veces 99% etanol. Haga un mínimo de 20 inmersiones en cada frasco, y deje reposar la cuna en 99% de etanol hasta que estén montadas.
    7. Monte los cubreobjetos aplicando una pequeña cantidad del medio de montaje a la superficie de las diapositivas. Coloque el cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje sin crear burbujas debajo de la cubierta. Dejar secar durante 24 h.
    8. Examine el tejido con un microscopio de luz conectado a una cámara para obtener fotos histológicas. Utilice un objetivo 10x para tomar instantáneas hasta que se alcance una cobertura completa de la diapositiva de tejido.

4. Medición de la profundidad de la cripta y/o altura de villus

  1. Descargue e instale el software de análisis (es decir, Zen Lite, Tabla de materiales).
  2. Abra la imagen en el software y conéctese a la cámara. Tome instantáneas en modo cámara con objetivo 20x.
  3. En el modo de procesamiento, abra la instantánea.
  4. Para medir la profundidad de la cripta: en la vista 2D,seleccione la herramienta de línea en la pestaña de gráficos. Repita esta acción para 20 criptas bien orientadas (FiguraSuplementaria 1).
  5. Para medir la altura de las vellosidades: en la vista 2D,seleccione la herramienta de línea en la pestaña gráfica. Repita esta acción para 20 vellosidades bien orientadas (FiguraSuplementaria 1).
  6. Cambie de la vista 2D a la vista Medir para mostrar las medidas.
  7. Exporte las mediciones y calcule el promedio de la profundidad de la cripta y la altura de vellosidades.

5. Cuantificación de BrdU (proliferación) por inmunohistoquímica

  1. Inyección de la solución BrdU
    1. Pesar y registrar el peso corporal de los ratones.
    2. En una campana de humos, prepare una cantidad representativa de 0,5% p/v de solución de bromodeoxiuridina (BrdU) en solución salina tamponada de fosfato (PBS).
    3. En la campana de humos, inyectar 50 mg/kg de BrdU por inyección intraperitoneal.
      NOTA: Para asegurarse de que cada ratón se eutanasia exactamente a 150 minutos después de la inyección de BrdU, inyecte cada ratón individual sucesivamente con un intervalo de 10 a 20 minutos en el medio para realizar correctamente la recolección de tejido.
    4. Registre el tiempo de inyección.
    5. Espere 150 minutos, luego anestetizar ratones y recoger el tejido como se describe en los pasos 2.1-2.7. Realizar inmunohistoquímica BrdU como se describe en la sección 5.2.
  2. Inmunohistoquímica de BrdU
    1. Prepare el tejido como se describe en los pasos 3.1.1 a 3.3.4.
    2. Para la recuperación de antígenos, coloque una base de diapositivas con las secciones en un frasco de histología de vidrio y llénela con el tampón EDTA (pH 9) en un horno microondas durante 1 min a 750 W seguido de 9 min a 350 W. Ciclo de repetición.
      NOTA: Asegúrese de que el tejido no se seque, lo que podría requerir agregar más tampón a los frascos entre el calentamiento.
    3. Lave las secciones 2 a 3 veces en solución salina tris-buffered y tampón de polisorbato 20 (TBS-T) durante 3 min cada uno.
    4. Aplicar 5 gotas de bloque de peróxido (Tablade materiales)durante 10 a 15 min a temperatura ambiente para bloquear la actividad endógena de peroxidasa. Lave las secciones 2 a 3 veces en el búfer TBS-T durante 3 minutos cada una.
    5. Aplique 5 gotas de búfer de bloque de roedores (Tablade materiales)durante 30 minutos a temperatura ambiente, para bloquear la unión no específica. Lave las secciones 2 a 3 veces en el búfer TBS-T durante 3 minutos cada una.
    6. Incubar las secciones con un anticuerpo anti-BrdU de ratón monoclonal diluido 1:500 durante 1 h a temperatura ambiente. Lave las secciones 2 a 3 veces en el búfer TBS-T durante 3 minutos cada una.
    7. Visualice la inmunopositividad utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) aplicando 5 gotas de peroxidasa de rábano picante a cada tobogán e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera las secciones a una campana de humo, agregue 150 s de DAB e incubar durante 5 min.
      NOTA: Use siempre guantes cuando manipule DAB y deseche los residuos adecuadamente.
    8. Enjuague las secciones en agua desionizada.
    9. Deshidratar el tejido y montar un cubreobjetos como se describe en los pasos 3.4.6 y 3.4.7.
  3. Visualización de las inmunorreaciones
    1. Visualice la muestra de tejido con un microscopio de luz conectado a una cámara.
    2. Utilice el software de análisis para obtener imágenes de microscopio utilizando un objetivo 20x de todas las secciones y guardar archivos en el archivo . Formato JPG.
    3. Tome una instantánea de un micrómetro de etapa utilizando un objetivo de 20x, que se utilizará como herramienta de calibración en el software ImageJ.
  4. Medición del área de las células inmunorreactivas de BrdU
    1. Instale el software ImageJ (Tablade materiales).
    2. Asignación de escala a una imagen en ImageJ: Abra la imagen del micrómetro de etapa con el archivo ImageJ . Abra el comando de menú. Seleccione la herramienta de selección en línea recta.
    3. Seleccione la herramienta recta y dibuje una línea recta en la imagen del micrómetro para definir una distancia conocida.
    4. Seleccione Establecer escala en el menú Analizar.
    5. Introduzca un valor en el cuadro Distancia conocida y defina la unidad de longitud en el cuadro Unidad de longitud. Seleccione Global para que esta calibración se aplique a todas las imágenes que se abren en esta sesión de ImageJ.
    6. Abra una imagen de interés utilizando el archivo ImageJ . Abra el comando de menú para medir el área de las células inmunorreactivas de BrdU por cripta.
    7. Establezca los gráficos en color en 8 bits en el menú Imagen/Tipo.
    8. Aumente el contraste de la imagen en Procesar/Mejorar el contraste y establezca los píxeles saturados en 0,4%.
    9. Aplique un umbral a la imagen para segmentar la inmunopositividad. Seleccione Imagen/Ajustar en el menú, luego umbral y seleccione el color Rojo (área oscura que se muestra en rojo). Elija un umbral de alrededor del 10-20% moviendo la barra de umbral.
      NOTA: Elija un umbral que incluya todas las celdas positivas de BrdU con el menor fondo posible. El porcentaje elegido debe aplicarse a todas las secciones.
    10. Elija una cripta bien orientada, es decir, una cripta completa de tejido intacto, y seleccione la herramienta de selección de mano libre para marcar el área a su alrededor.
    11. Para medir el área de umbral, seleccione la ficha Analizar, seguida de Analizar partículas. En la ventana Analizar partícula, establezca Tamaño en 20infinitos , haga clic en el cuadro unidades de píxeles, establezca Circularidad en 0,00-1,00y establezca Mostrar en Contornos. Haga clic en los cuadros Visualizar resultados, Resumire Incluir taladros.
      NOTA: Los valores de las celdas positivas de BrdU se generan automáticamente en una ventana de resultados, mostrando las mediciones individuales para cada celda positiva de BrdU. Además, se genera automáticamente una ventana de resumen, que muestra el número de recuentos, el área total, el tamaño medio y el porcentaje de área con celdas positivas BrdU.
    12. Repita los pasos 5.4.10 y 5.4.11 para medir una nueva cripta. Los resultados de todas las criptas medidas se mostrarán en la ventana Resumen.

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Resultados

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En el primer experimento, inducimos la mucositis en ratones en el día 0 y sacrificamos un grupo de ratones cada día durante 5 días consecutivos. Al medir el peso SI, encontramos que este parámetro disminuyó desde el día 2 hasta el día 4 sugiriendo una pérdida en la masa enterocitos. También encontramos que en el día 5, el peso SI no era significativamente diferente del día 0 (ratones no tratados) (Figura1). La proliferación medida por la incorporación del Brd...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, demostramos un método ampliamente accesible para estudiar la lesión SI y la regeneración en un modelo de ratón. Existe una amplia variedad de modelos animales preclínicos de lesión intestinal, pero es vital que entendamos que cada modelo es único y que los puntos finales deben ser apropiados para responder a la pregunta de investigación. Este modelo es excelente para estudiar la respuesta adaptativa a la lesión, pero los puntos finales deben modificarse cuando se utiliza el modelo como un modelo preclínico de mucos...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por una subvención sin restricciones del Novo Nordisk Center for Basic Metabolic Research y la Fundación Lundbeck.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-FluorouraciloHospira Nordic AB, Suecia137853
Ketaminol® VeterinarioMerck, Nueva Jersey, EE. UU.511485
Rompun® Veterinario XylazineRompunvet, Bayer, Leverkusen, Alemania.
Tampón de formalina natural al 10%Cell Path Ltd, Powys, Reino UnidoBAF-5000-08A
HistoClearNational Diagnostics, Reino UnidoHS-200
PertexHistoLab®, Suecia840
BrdUSigma-Aldrich, Alemania.B5002
Tampón de pH 9 Tris/EDTAThermofisher scientific, DinamarcaTA-125-PM4X
Bloque de peróxidoUltravision Quanto Kit de ratón en ratón, Thermofisher Scientific, DinamarcaTL-060-QHDM
Tampón de bloque de roedoresUltravision Quanto Kit de ratón en ratón, Thermofisher Scientific, DinamarcaTL-060-QHDM
Anticuerpo anti-BrdU monoclonal de ratónThermofisher Scientific, Dinamarca.MA1-81890
Diluyente de anticuerpos Lab Vision OP QuantoThermofisher Scientific, Dinamarca.TA-125-ADQ
Peroxidasa de rábano picanteUltravision Quanto Mouse en kit de ratón, Thermofisher Scientific, DinamarcaTL-060-QHDM
DAB Quanto SubstrateKit de sustrato DAB, Thermofisher Scientific, DinamarcaTA-125-QHDX
DAB Quanto ChromogenDAB Kit de sustrato, Thermofisher Scientific, DinamarcaTA-125-QHDX
Zen Lite Software (edición azul)Carl Zeiss A/Shttps://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ SoftwareLOCI, Universidad de Wisconsinhttps://imagej.nih.gov/ij/
148999

Referencias

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