Puntos finales importantes y marcadores proliferativos para evaluar lesiones intestinales pequeñas y adaptación utilizando un modelo de ratón de mucositis inducida por quimioterapia

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para establecer puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeña lesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular y utilizando el peso intestinal pequeño, la profundidad de la cripta y la altura de las vellosidades como puntos finales.

Resumen

La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural que se produce cuando el intestino se pierde debido a un trauma. Las respuestas adaptativas, como la proliferación de células de cripta y el aumento de la absorción de nutrientes, son fundamentales en la recuperación, pero mal entendidas. Comprender el mecanismo molecular detrás de las respuestas adaptativas es crucial para facilitar la identificación de nutrientes o fármacos para mejorar la adaptación. A lo largo de la literatura se han descrito diferentes enfoques y modelos, pero se necesita una forma descriptiva detallada de realizar esencialmente los procedimientos para obtener datos reproducibles. Aquí, describimos un método para estimar puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeñalesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia en ratones. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular, así como el uso de peso intestinal pequeño, profundidad de la cripta y altura de vellosidad como puntos finales. Algunos de los pasos críticos dentro del método descrito son la extracción y el pesaje del intestino delgado y el sistema de software bastante complejo sugerido para la medición de esta técnica. Estos métodos tienen las ventajas de que no consumen mucho tiempo y que son rentables y fáciles de llevar a cabo y medir.

Introducción

La adaptación intestinal es el mecanismo compensatorio natural quese produce cuando el intestino se pierde debido a una enfermedad o cirugía 1,^2. Después del trauma, el intestino se somete a una respuesta adaptativamorfométrica y funcional, caracterizada por la proliferación celular de la cripta y el aumento de la absorción de nutrientes 3. Este paso es fundamental en la recuperación, pero mal entendido. Los estudios experimentales de la respuesta adaptativa intestinal se han centrado en los cambios que se producen después de la resección del intestino delgado en ratones, ratas y cerdos....

Protocolo

Todos los métodos descritos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de la legislación danesa que rige la experimentación con animales (1987). Los estudios se realizaron con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentos Animales (2013-15-2934-00833) y del comité ético local.

NOTA: Los ratones hembra C57BL/6J (20 a 25 g) se obtuvieron y albergaron ocho por jaula en luz estándar de 12 h, ciclo oscuro de 12 h con acceso gratuito al agua y comida estándar. Los animales fueron dejados para aclimatarse durante una semana antes de que comenzaran los experimentos.

1. Inducción de la mucositis con 5-fluoro....

Resultados

En el primer experimento, inducimos la mucositis en ratones en el día 0 y sacrificamos un grupo de ratones cada día durante 5 días consecutivos. Al medir el peso SI, encontramos que este parámetro disminuyó desde el día 2 hasta el día 4 sugiriendo una pérdida en la masa enterocitos. También encontramos que en el día 5, el peso SI no era significativamente diferente del día 0 (ratones no tratados) (Figura1). La proliferación medida por la incorporación del Brd.......

Discusión

Aquí, demostramos un método ampliamente accesible para estudiar la lesión SI y la regeneración en un modelo de ratón. Existe una amplia variedad de modelos animales preclínicos de lesión intestinal, pero es vital que entendamos que cada modelo es único y que los puntos finales deben ser apropiados para responder a la pregunta de investigación. Este modelo es excelente para estudiar la respuesta adaptativa a la lesión, pero los puntos finales deben modificarse cuando se utiliza el modelo como un modelo preclínico de mucos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-Fluorouracilo	Hospira Nordic AB, Suecia	137853
Ketaminol® Veterinario	Merck, Nueva Jersey, EE. UU.	511485
Rompun® Veterinario Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Alemania.
Tampón de formalina natural al 10%	Cell Path Ltd, Powys, Reino Unido	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, Reino Unido	HS-200
Pertex	HistoLab®, Suecia	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Alemania.	B5002
Tampón de pH 9 Tris/EDTA	Thermofisher scientific, Dinamarca	TA-125-PM4X
Bloque de peróxido	Ultravision Quanto Kit de ratón en ratón, Thermofisher Scientific, Dinamarca	TL-060-QHDM
Tampón de bloque de roedores	Ultravision Quanto Kit de ratón en ratón, Thermofisher Scientific, Dinamarca	TL-060-QHDM
Anticuerpo anti-BrdU monoclonal de ratón	Thermofisher Scientific, Dinamarca.	MA1-81890
Diluyente de anticuerpos Lab Vision OP Quanto	Thermofisher Scientific, Dinamarca.	TA-125-ADQ
Peroxidasa de rábano picante	Ultravision Quanto Mouse en kit de ratón, Thermofisher Scientific, Dinamarca	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	Kit de sustrato DAB, Thermofisher Scientific, Dinamarca	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Kit de sustrato, Thermofisher Scientific, Dinamarca	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (edición azul)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, Universidad de Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/

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