El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.
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Artículo de método
Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas
En este artículo
Resumen
Resumen
La neurogénesis adulta es un proceso dinámico mediante el cual las células madre neurales recién activadas (NSC) en la zona subgranular (SGZ) del gyrus dentado (DG) generan nuevas neuronas, que se integran en un circuito neural existente y contribuyen a funciones específicas del hipocampo . Es importante destacar que la neurogénesis adulta es altamente susceptible a los estímulos ambientales, lo que permite la regulación dependiente de la actividad de varias funciones cognitivas. Una amplia gama de circuitos neuronales de varias regiones cerebrales orquesta estas complejas funciones cognitivas. Por lo tanto, es importante entender cómo los circuitos neuronales específicos regulan la neurogénesis adulta. Aquí, describimos un protocolo para manipular la actividad del circuito neural utilizando el receptor de diseño activado exclusivamente por la tecnología de drogas de diseño (DREADD) que regula los NSC y la progenie neonatal en roedores. Este protocolo integral incluye inyección estereotaxcócica de partículas virales, estimulación quimiogenética de circuitos neuronales específicos, administración analógica de timidina, procesamiento de tejidos, etiquetado de inmunofluorescencia, imágenes confocales e imágenes análisis de varias etapas de las células precursoras neuronales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre las técnicas de recuperación de antígenos utilizadas para visualizar los NSC y su progenie y describe una forma simple, pero eficaz de modular los circuitos cerebrales utilizando el óxido N de clozapina (CNO) o el agua potable que contiene CNO y Virus que expresan dREADDs. La fuerza de este protocolo radica en su adaptabilidad para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales que influyen en la neurogénesis adulta derivada de los NSC.
Introducción
La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes1. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales esp....
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Protocolo
Todos los procedimientos, incluidos los sujetos de animales, han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Capilla de la Universidad de Carolina del Norte.
1. Inyección estereotaxica de partículas virales
- Determine los circuitos neuronales en cuestión. Esto determinará el virus y la línea del ratón utilizado para el siguiente procedimiento.
NOTA: Para este ejemplo, se estimulan las proyecciones celulares musgosas contralaterales para analizar sus efectos en la neurogénesis adulta. Las partículas virales que codifican AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry se entregan a la DG de ....
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Resultados
Siguiendo los procedimientos experimentales descritos anteriormente (Figura1A,B), pudimos determinar los efectos de estimular las proyecciones celulares musgosas contralaterales en el nicho neurogénico dentro del hipocampo. Mediante la utilización de un virus DREADD estimulante dependiente de Cre-dependiente gq emparejado con un etiquetado de células musgosas 5-HT2A Cre-line, pudimos activar selectivamente proyecciones excitatorias de células musgosas en la DG contralateral .......
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Discusión
El objetivo de este protocolo es evaluar cómo la manipulación de circuitos neuronales específicos regula la neurogénesis hipocampal en adultos in vivo utilizando una serie de técnicas de inmunohistoquímica. Decir regulación dependiente de la actividad de la neurogénesis adulta mediada por circuitos neuronales específicos es una técnica valiosa con gran potencial para modificaciones para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, incluyendo la adm.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
L.J.Q. fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo suplemento de diversidad R01MH111773, así como una beca de capacitación T32TS07431-20. Este proyecto fue apoyado por subvenciones otorgadas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160 y NS104530).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 24 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Placa de 48 pocillos | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-etinil-2'-desoxiuridina (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| alcohol 70% isopropílico | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Almohadillas de preparación de alcohol | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Cabra DCX | Santa Cruz | Gato# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Ratón Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Solución de Betadine (povidona yodada) | Stock de ácido cítrico amazónico | ||
| [.1M] Ácido cítrico (21 g / L de ácido cítrico) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapina N- Óxido | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Software Confocal (Zen Black) | Microscopía Zeiss | Zen 2.3 SP1 FP1 (negro) | |
| Pentahidrato | Thermo Fisher Scientific AC197722500 | ||
| Hisopos de algodón | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Toallita para tareas delicadas Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Broca 0,5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Etilenglicol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Aguja Hamilton 2 pulgadas | Compañía Hmailton | 7803-05 | |
| Jeringa Hamilton 5 μ L Modelo 75 RN | Hmailton Referencia de la empresa | : 87931 | |
| Taladro de alta velocidad | Foredom | 1474 | |
| Bomba de infusión | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Solución salina inyectable | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Jeringa de insulina | BD Jeringas de insulina ultrafinas | ||
| Isoflurano | Henry Schein | 29405 | |
| Estereotax para pequeños animales | KOPF Instruments Modelo | 942 | |
| Leica M80 | Leica Leica | ||
| Microtomo Leica | SM2010 R | ||
| LSM 780 | Zeiss Microscopía | ||
| Nair (Producto de depilación) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | ||
| Plus Portaobjetos cargados | Denville Scientific | M1021 | |
| Solución tamponada de fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Opomada | Puralube | ||
| Portaobjetos 20 unidad de portaobjetos | Electrónica Microscopía Ciencia | 70312-24 | |
| Portaobjetos Soporte de portaobjetos | Ciencia de la Microscopía Electrónica | 70312-25 | |
| Almohadilla térmica para animales pequeños | K& H | ||
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pluma punta de 4 mm | PolySciences | 24230 | |
| Bisturí quirúrgico | MedPride | 47121 | |
| Tris Solución tamponada (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Caldo de citrato trisódico [0,1 M] Citrato trisódico (29,4 g/L citrato trisódico) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Pinzas | Amazon | ||
| Vet Bond Adhesivo para tejidos | 3M | 1469SB |
Referencias
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R.
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Reimpresiones y permisos
