El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.
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Artículo de método
Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas
En este artículo
Resumen
Resumen
La neurogénesis adulta es un proceso dinámico mediante el cual las células madre neurales recién activadas (NSC) en la zona subgranular (SGZ) del gyrus dentado (DG) generan nuevas neuronas, que se integran en un circuito neural existente y contribuyen a funciones específicas del hipocampo . Es importante destacar que la neurogénesis adulta es altamente susceptible a los estímulos ambientales, lo que permite la regulación dependiente de la actividad de varias funciones cognitivas. Una amplia gama de circuitos neuronales de varias regiones cerebrales orquesta estas complejas funciones cognitivas. Por lo tanto, es importante entender cómo los circuitos neuronales específicos regulan la neurogénesis adulta. Aquí, describimos un protocolo para manipular la actividad del circuito neural utilizando el receptor de diseño activado exclusivamente por la tecnología de drogas de diseño (DREADD) que regula los NSC y la progenie neonatal en roedores. Este protocolo integral incluye inyección estereotaxcócica de partículas virales, estimulación quimiogenética de circuitos neuronales específicos, administración analógica de timidina, procesamiento de tejidos, etiquetado de inmunofluorescencia, imágenes confocales e imágenes análisis de varias etapas de las células precursoras neuronales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre las técnicas de recuperación de antígenos utilizadas para visualizar los NSC y su progenie y describe una forma simple, pero eficaz de modular los circuitos cerebrales utilizando el óxido N de clozapina (CNO) o el agua potable que contiene CNO y Virus que expresan dREADDs. La fuerza de este protocolo radica en su adaptabilidad para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales que influyen en la neurogénesis adulta derivada de los NSC.
Introducción
La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes1. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales específicas, incluyendo el aprendizaje y la memoria, regulación del estado de ánimo, y la respuesta al estrés3 ,4,5,6. Para influir en los comportamientos, los SCN adultos están altamente regulados por varios estímulos externos de una manera dependiente de la actividad respondiendo a una serie de señales químicas locales y distales. Estas señales químicas incluyen neurotransmisores y neuromoduladores y actúan de una manera específica de circuito de varias regiones cerebrales. Es importante destacar que la convergencia de circuito según estas señales químicas en los SCN permite una regulación única y precisa de las decisiones de activación, diferenciación y destino de células madre.
Una de las formas más efectivas de interrogar la regulación del circuito de los NSC adultos in vivo es emparejando el análisis de inmunofluorescencia con manipulaciones de circuitos anchos. El análisis de inmunofluorescencia de los SCN adultos es una técnica comúnmente utilizada, donde los anticuerpos contra marcadores moleculares específicos se utilizan para indicar la etapa de desarrollo de los SCN adultos. Estos marcadores incluyen: nestin como célula de glia radial y marcador de progenitor neural temprano, Tbr2 como marcadorde progenitor intermedio, y dcx como marcador de neurona neuroblast e inmaduro 7. Además, mediante la administración de análogos de timidina como BrdU, CidU, Idu, y Edu, las poblaciones celulares sometidas a la fase S se pueden etiquetar y visualizar individualmente8,9,10. Mediante la combinación de estos dos enfoques, se puede investigar una amplia gama de preguntas que van desde cómo se regula la proliferación en etapas específicas del desarrollo, hasta cómo diversas señales afectan a la diferenciación de nSC y la neurogénesis.
Existen varias opciones para manipular eficazmente los circuitos neuronales, incluyendo la estimulación eléctrica, la optogenética y la quimiogenética, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. La estimulación eléctrica implica una cirugía extensa donde los electrodos se implantan en una región cerebral específica que más tarde se utilizan para transmitir señales eléctricas para modular una región cerebral dirigida. Sin embargo, este enfoque carece de especificidad celular y de circuito. La optogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor activado por luz que es estimulado por un láser emitido a través de una fibra óptica implantada, pero requiere manipulaciones extensas, gran costo y cirugías complejas11. La quimiogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor de diseño activado exclusivamente por fármacos de diseño o DREADD, que posteriormente son activados por un ligando específico y biológicamente inerte conocido como óxido N de clozapina (CNO)12 . La ventaja de utilizar DREADD para manipular circuitos neuronales locales que regulan los SCN adultos radica en la facilidad y varias rutas de administración de CNO. Esto permite un enfoque menos lento con un manejo animal reducido, que es fácilmente adaptable para estudios a largo plazo para modular los circuitos neuronales.
El enfoque descrito en este protocolo es una colección completa de varios protocolos necesarios para interrogar con éxito la regulación del circuito de la neurogénesis del hipocampo adulto que combina tanto técnicas de inmunofluorescencia como manipulaciones de circuitos uso de la quimiogenética. El método descrito en el siguiente protocolo es adecuado para estimular o inhibir uno o varios circuitos simultáneamente in vivo para determinar su función reguladora en la neurogénesis adulta. Este enfoque se utiliza mejor si la pregunta no necesita un alto grado de resolución temporal. Las preguntas que requieren un control temporal preciso de la estimulación/inhibición a una frecuencia determinada, pueden abordarse mejor utilizando optogenética13,14. El enfoque descrito aquí se adapta fácilmente para estudios a largo plazo con un manejo mínimo de animales, especialmente cuando el estrés es una preocupación importante.
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Protocolo
Todos los procedimientos, incluidos los sujetos de animales, han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Capilla de la Universidad de Carolina del Norte.
1. Inyección estereotaxica de partículas virales
- Determine los circuitos neuronales en cuestión. Esto determinará el virus y la línea del ratón utilizado para el siguiente procedimiento.
NOTA: Para este ejemplo, se estimulan las proyecciones celulares musgosas contralaterales para analizar sus efectos en la neurogénesis adulta. Las partículas virales que codifican AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry se entregan a la DG de ratones 5ht2A-Cre15. - Administrar meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) al menos 30 minutos de forma preoperatoria para proporcionar analgesia preventiva a un ratón heterocigoto 5ht2A-Cre macho de 8 semanas de edad.
- Anestetiza el ratón usando una mezcla de oxígeno isoflurano del 4% hasta que su respiración se desacelere y el ratón esté inconsciente usando una cámara de isoflurano. Pellizcar el ratón para asegurarse de que no responde.
- Coloque el ratón en el estereoimpuesto en una pequeña almohadilla de calentamiento animal para la regulación térmica y aplique lubricante para los ojos en cada ojo. Reducir el isoflurano a 1,5% una vez que el animal esté dentro de la estereotasa.
NOTA: La colocación de la barra de oído durante esta etapa es importante. Asegúrese de que la cabeza esté nivelada después de la colocación de la barra del oído. Las instrucciones más detalladas se pueden encontrar en Geiger et al.16. - Coloque el producto de depilación en la cabeza y déjelo reposar hasta 1 minuto como máximo. Retire el cabello limpiando la cabeza con toallitas de etanol. Si el cabello no se elimina por completo, repita este proceso hasta que la parte superior de la cabeza no sea saldepiz.
- Desinfectar la zona sin pelo con una solución de povidona-yodo al menos 3 veces.
- Colocar la solución tópica de lidocaína en la piel sin pelo de la cabeza y esperar 1 min. Retire la lidocaína tópica de la cabeza y haga una pequeña incisión en la cabeza desde el inicio de los ojos hasta el inicio de las orejas de unos 2 mm usando un bisturí quirúrgico.
NOTA: Pellizcar el ratón con el dedo del ratón para asegurarse de que está completamente sedado antes de hacer cualquier incisión. - Retraiga el cuero cabelludo y limpie el tejido conectivo en la parte superior de la cabeza usando hisopos de algodón esterilizados hasta que el bregma sea fácilmente identificable.
- Localice el bregma y ajuste la cabeza para que el bregma y el lambda estén en el mismo plano colocando el taladro en ambas coordenadas y asegurándose de que se alineen. Además, alinee el hemisferio izquierdo y derecho colocando el taladro a la izquierda/derecha de una región entre bregma y lambda.
NOTA: Este paso es muy importante; la colocación de la cabeza mal alineada interrumpirá las coordenadas estereotaxias. - Taladre las siguientes coordenadas de bregma utilizando una broca de 0,5 mm: eje posterior anterior (AP) -2,00 mm, eje lateral medial (ML) +1,50 mm. Haga un agujero de taladro de 0,5 mm a 1 mm de diámetro.
NOTA: Modifique este paso con coordenadas específicas del circuito en cuestión. Este ejemplo se dirige a un génóxido dentado unilateral que contiene células musgosas y determina su efecto en las células madre neurales adultas en el lado contralateral. - Cambie la broca a una jeringa de 5 l y una aguja de 26 a 33 G. Cero en bregma y luego inyectar en las siguientes coordenadas colocando la aguja en el orificio de perforación en el eje anterior anterior -2,00 mm, eje lateral medial -1,50 mm, eje ventral dorsal -2,3 mm.
- Infundir 500 nL de virus asociadoa a adeno (AAV) desde un núcleo viral o una fuente comercial al hemisferio adecuado, a 50 a 100 nL/min utilizando una bomba de perfusión (Tablade materiales). Espere al menos 5 minutos después de la inyección antes de retirar lentamente la aguja del cerebro.
NOTA: Estas coordenadas pueden requerir un ajuste basado en la edad y el tamaño del ratón. Ciertos serotipos virales tienen diferentes patrones de difusión, es mejor realizar experimentos piloto para probar la propagación viral antes de un experimento completo. - Limpie el cuero cabelludo y la piel alrededor de la incisión usando salina, luego selle la incisión usando adhesivo de tejido (Tablade Materiales)mientras sostiene la piel junto con pinzas. Realice todos los procedimientos postoperatorios, como la monitorización durante la recuperación en una almohadilla de calentamiento hasta que el ratón esté activo, la aplicación de analgésicos en la herida y la administración de analgésicos durante dos días.
NOTA: Muchos experimentos requieren un tiempo de espera de 2 a 4 semanas después de la perfusión viral para una expresión viral adecuada.
2. Administración de óxido n de clozapina
- Preparar una solución de CNO en stock disolviendo 10 mg de CNO en 100 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y vórtice.
NOTA: Si la solución no se disuelve por completo, aumente el volumen de DMSO, pero demasiado DMSO puede hacer que el agua amarga. No exceda el 0,1% de DMSO en la solución de agua CNO o más de 200 ml de DMSO para una solución de 200 ml. La solución de stock CNO se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de dos semanas. - Añadir una solución de CNO de 10 a 50 l de 10 mg/100 l a cada 200 ml de agua para una concentración final de 1 x 5 mg/200 ml. Prepare la mezcla de agua CNO fresca todos los días.
NOTA: Algunos grupos han suplementado hasta 1% de sacarina en el agua para enmascarar la amargura si los ratones se abstienen de beber. El circuito investigado mostró una respuesta diferente basada en el grado de activación. En general, 1 mg CNO/200 ml es suficiente para estimular la mayoría de los circuitos17. - Coloque la solución de CNO en un recipiente cubierto de papel de aluminio o protegido contra la luz cuando se administre a ratones dos semanas después de la recuperación de la inyección de esteretaxica del paso 1.13 durante un período de 4 días.
NOTA: El CNO es sensible a la luz; reducir la exposición a la luz durante todo el proceso. - Mida y registre la solución de agua CNO consumida todos los días al preparar una solución de CNO fresca. En promedio, un ratón adulto consumirá alrededor de 4 ml de mezcla de agua CNO. Además, registre el peso del ratón diariamente para asegurarse de que están bebiendo.
- Asegúrese de que se utilizan los controles adecuados para cada experimento. Incluya un control CNO y DREADD. Un ejemplo de una configuración experimental sería: (1) vehículo + vehículo anfibio autónomo (AAV) con reportero viral sin DREADD, (2) CNO + AAV con reportero viral sin DREADD, y (3) CNO + AAV DREADD.
NOTA: Todos los grupos incluyen DMSO en la solución. Los controles DMSO no están incluidos porque los animales están recibiendo menos del 0,1% de DMSO, lo que no ha demostrado tener efectos adversos sobre las células madre neurales adultas en ratones. Si hay preocupaciones con respecto al uso de DMSO en el agua potable, agregue un adicional sin DMSO y control salino.
3. Etiquetado analógico de timidina
-
El día de recolección de tejido, 4 días después de la administración de CNO, etiquetar las células que proliferan mediante la realización de una serie de inyecciones intraperitoneales análogas de timidina, 5-etil-2'-desoxiuridina (Edu).
NOTA: Este protocolo utiliza Edu. Sin embargo, hay varios análogos de timidina que pueden etiquetar eficientementelas poblaciones celulares que proliferan, incluyendo Brdu, Idu y Cidu 8.- Pesar Edu y disolver en grado veterinario 0.9% solución inyectable de cloruro de sodio a 4 mg/ml por vórtice y colocación en un rotor durante 15 min.
NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos y sensibles a la luz. Siga las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) al manipular y cubrir la solución de la exposición a la luz utilizando papel de aluminio. - Administrar Edu por vía intraperitoneal a 40 mg/kg o 0,1 mL/10 g de peso corporal de la solución Edu de 4 mg/ml 4 veces cada 2 h.
NOTA: Las dosis superiores a 50 mg/kg alcanzan cerca de los niveles de saturación y no aumentarán significativamente la cantidad de células proliferantes etiquetadas18. Es crucial que todos los ratones reciban la misma cantidad de inyecciones de Edu, ya que el etiquetado incorrecto puede sesgar los resultados.
- Pesar Edu y disolver en grado veterinario 0.9% solución inyectable de cloruro de sodio a 4 mg/ml por vórtice y colocación en un rotor durante 15 min.
4. Preparación y procesamiento de tejidos
- Dos horas después de la última inyección de Edu, anestesia el ratón con una cámara de isoflurano hasta que la respiración se reduzca significativamente y pellizca los dedos de los dedos para asegurarse de que está completamente sedado.
- Asegure el ratón a la superficie usando agujas y haga una pequeña incisión exponiendo el corazón. Inserte una aguja de 25 G en la aorta izquierda y corte el ventrículo derecho para la perfusión transcardial con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a un caudal de 1 x 4 ml/min hasta que se despeje el tejido hepático.
- Cambie la solución de perfusión a 4% de paraformaldehído (PFA) y percire alrededor de 15 a 20 ml para fijar el tejido cerebral.
NOTA: Se pueden encontrar instrucciones más detalladas sobre el proceso de perfusión en Gage et al.19. Se observarán temblores de animales cuando se hagan correctamente. - Retire la cabeza usando un par de tijeras grandes y luego realice una serie de incisiones cuidadosas para liberar el cerebro del cráneo. Almacene el tejido cerebral a 4 oC en 4% de PFA durante la noche para continuar la fijación.
- Retire el tejido cerebral de la solución de PFA al 4% y colóquelo en una solución de sacarosa al 10% en PBS para crioproteger el tejido durante 24 h a 4 oC. A continuación, transfiera el tejido a una solución de PBS de sacarosa del 30% para otras 24 h a 4 oC antes de la sección.
NOTA: El tejido cerebral se hundirá en sacarosa cuando esté listo para la sección del microtome. El tejido cerebral se puede almacenar a largo plazo en 30% sacarosa. - Seccionar el tejido cerebral coronalmente en secciones de 40 m utilizando un microtome. Recoger secciones que comienzan al inicio del gyrus dentate, alrededor de -1,20 mm de bregma, y terminando después de que la placa se completa con la primera sección siendo la más anterior y la última sección siendo la más posterior. Consulte un atlas cerebral de ratón para identificar con precisión la DG y las coordenadas de recolección de tejido inicial.
- Almacene en serie cada sección en filas de 6 en una placa de 48 pocillos llena de solución anticongelante (Tabla1).
| Solución anticongelante | Etilenglicol 150 mL + sacarosa 150 g + llenado a 500 mL 0,1 M PB para solución de 500 ml |
| Tampón de citrato | 9 ml de caldo de ácido cítrico + 41 ml de tampón de citrato trisódico + 450 ml de ddH2O |
| Stock de ácido cítrico | [0,1 M] Acido cítrico 21 g/1 L ddH2O |
| Stock de citrato de trisódico | [0,1 M] Citrato de trisódico 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris Saline tamponado -Triton (TBS -Triton) | 0.05% 100-x Triton en TBS |
| Zona de influencia de permeabilización | 0.5% 100-x Triton en TBS |
| Bloqueo de búfer | 0.33 mL Donkey Serum en 10 mL TBS-Triton |
| Solución de reacción Edu | Realice una solución de CuSO4x 5H2O añadiendo 1 mg de CuSO4x 5H2O en una solución de 4 ml de [0,1 M] Tris pH 8,5. A continuación, agregue 1:40 de una solución Alexa488-azida de 600 m y 10 mg/ml de L-Na+ ascorbato a la solución de CuSO4x 5H2O antes de aplicarla sobre el tejido. |
Tabla 1: Soluciones utilizadas para la inmunohistoquímica.
5. Inmunohistoquímica
- Protocolo flotante básico
NOTA: Si tiñe la anidación, omita la sección 5.1 y proceda a la sección 5.2. El protocolo flotante básico es para Tbr2 o doublecortin (DCX) sólo sin tinción Edu analógica de timidina.- Transfiera secciones de la solución anticongelante a la solución salina tris-buffered (TBS) en orden de serie en una placa de 48 pocillos.
- Lave las secciones dos veces en TBS-triton (0,05% TBS-triton, Tabla 1) durante 5 minutos aspirando la solución cada vez mientras agita o en un balancín a velocidades lentas.
- Permeabilice las secciones utilizando el búfer de permeabilización (0,5% TBS-triton, Tabla 1) durante 20 a 30 minutos mientras se agita a velocidades lentas.
- Realice el búfer de bloqueo agregando 0,33 ml de suero de burro a 10 ml de TBS-tritón. Hacer fresco y usar dentro de 3 días.
- Aspirar tampón de permeabilización e incubar secciones en tampón de bloqueo durante 30 min a 1 h a temperatura ambiente (RT).
- Haga la solución de anticuerpos primarios en el búfer de bloqueo y agréguela a cada pozo. 500 l/pozo es suficiente para que todas las secciones de tejido estén completamente sumergidas. Incubar durante la noche en RT en un balancín o coctelera.
- Aspirar las secciones de solución y enjuague en TBS-tritón 3x durante 10 min cada una para eliminar los rastros de anticuerpos primarios.
- Incubar en anticuerpos secundarios conjugados de fluoróforo contra anticuerpos primarios preparados en solución tampón de bloqueo durante 2 h a RT en un balancín.
- Lavar las secciones 3x durante 5 min cada una en TBS-triton y luego incubar secciones en solución de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (300 m de solución a 1:100) diluida en PBS durante 15 min.
- Lave las secciones 3x en PBS y monte secciones manteniendo el orden en serie de anterior a posterior en una diapositiva cargada positivamente. Deje que el tejido se seque en RT hasta que la humedad se haya ido visiblemente, generalmente unos 2 x 5 minutos, antes de cubrirse con medios de montaje.
- Recuperación de antígenos
NOTA: Esta sección es necesaria solo para la anidación. Si tiñe la nido, realice esta sección antes de la tinción analógica de timidina (sección 5.3). Evite la tinción Tbr2 o DCX con Edu.- Coloque las secciones de tejido en PBS y monte secciones de 5 a 8 en una diapositiva cargada positivamente manteniendo el orden en serie de anterior a posterior. Deje que las secciones de tejido se sequen en RT para adherirse completamente a los portaobjetos, lo que toma alrededor de 2 x 5 minutos.
- Prepare el tampón de citrato (Tabla1) en un recipiente, normalmente una caja de punta de pipeta de 1.000 ml.
- Caliente el tampón de citrato en un horno microondas (1.000 W) durante 5 min hasta que la solución esté hirviendo. Mientras la solución se está calentando, coloque las secciones montadas en un portaobjetos de vidrio de 20 diapositivas. Después de 5 min, coloque cuidadosamente el portaobjetos con secciones en la caja de pipetas.
- Ajuste la potencia del horno microondas al 50% y cocine el tiempo durante 7 minutos. Durante estos 7 minutos, detenga el microondas cuando la solución comience a hervir y continúe el microondas después de que se detenga la ebullición.
NOTA: El objetivo de este paso es mantener la temperatura del agua justo debajo de la temperatura de ebullición durante 7 minutos. Las instrucciones más detalladas se pueden encontrar en Hussaini et al.20. - Saque la caja caliente con tampón de citrato y diapositivas de tejido y colóquela en un cubo de hielo para enfriarla. Cubra para evitar que el hielo u otros materiales entren en la solución. Espere unos 30 minutos o hasta que la solución esté fresca para tocar.
- Proceda a la tinción analógica de timidina paso 5.3.2 si utiliza el análogo de timidina.
- Tinción análoga de timidina
NOTA: Comience aquí si mancha edu y Tbr2 o Edu y DCX.- Coloque las secciones de tejido en PBS y monte secciones de 5 a 8 en una diapositiva cargada positivamente manteniendo el orden en serie de la orientación anterior a posterior y la misma. Deje que las secciones de tejido se sequen para adherirse completamente a las diapositivas y luego dibuje un borde usando una pluma hidrófoba o una pluma PAP.
- Permeabilizar secciones con búfer de permeabilización (0,5% TBS-triton) durante 20 a 30 min. A continuación, lave las secciones 2x con TBS-triton durante 5 min cada una.
NOTA: La permeabilización ayuda a la penetración de anticuerpos intracelulares. El tiempo de permeabilización se puede ajustar dependiendo del grosor del tejido y la eficiencia de los anticuerpos. Alternativamente, uno puede aumentar la concentración de detergente para aumentar la potencia de permeabilización. Sin embargo, se debe tener cuidado de no permeabilizar durante demasiado tiempo ya que la fragilidad del tejido aumenta con el tiempo de permeabilización prolongado. - Prepare la solución de reacción Edu según la Tabla1. La concentración final de Alexa488-azida es de 15 m en 1 ml de solución de reacción Edu.
- Incubar secciones en solución de reacción Edu durante 30 min a 1 h y luego lavar 3 veces en TBS-tritón durante 5 min cada una. Cubra los portaobjetos en papel de aluminio para protegerlos de la luz después de este paso. En esta etapa, compruebe si la reacción de Edu funciona utilizando un microscopio fluorescente. Las células etiquetadas con Edu fluorarán bajo un microscopio de epifluorescencia.
- Protocolo de sección de tejido montado
- Bloquear las secciones de tejido montadas en una diapositiva del paso 5.3.4 utilizando tampón de bloqueo levantado en los mismos animales que el anticuerpo secundario, por ejemplo, suero de burro, durante 30 min a 1 h y luego lavar 2 veces en TBS-triton durante 5 min cada uno.
- Preparar la solución de anticuerpos primarios (es decir, antinestina de pollo) durante el paso de bloqueo mezclando anticuerpos primarios en la solución tampón de bloqueo a 1:200. 250 l por diapositiva es suficiente para garantizar que el tejido esté completamente sumergido en la solución.
- Incubar secciones de tejido en una solución primaria de anticuerpos durante la noche en RT después de bloquear los lavados. Modifique este paso en función del anticuerpo primario utilizado.
NOTA: Si los anticuerpos tienen un fondo alto o una unión no específica, la incubación a 4 oC en lugar de RT puede mejorar los resultados. Los anticuerpos con mala penetración de tejido se pueden dejar incubar durante 2 días si es necesario. - Incubar secciones de tejido 3x en TBS-tritón durante 5 min para eliminar el exceso de anticuerpos primarios. A continuación, incubar secciones de tejido en anticuerpos secundarios conjugados de fluoróforo (es decir, Alexa 647 anti-pollo a 1:200) preparados en solución tampón de bloqueo durante 2 horas a RT.
- Secciones de tejido de incubación 3x en TBS-triton durante 5 min para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios y aplicar 300 m de solución DAPI a 1:100 en PBS durante 15 min a RT.
- Incubar secciones de tejido 3x en PBS durante 5 min para eliminar el exceso de DAPI y eliminar el círculo de la pluma de papá pap de alrededor del tejido usando un hisopo de algodón o una toallita de tarea delicada. Deje que las secciones se sequen y luego aplique los medios de montaje y el resbalón de la cubierta. Deje que los medios de montaje se sequen antes de que se deslicen las imágenes.
6. Colección de imágenes
- Grupos experimentales ciegos de grupos de control cubriendo las etiquetas de las diapositivas y la imagen del mismo lado de la DG utilizando un microscopio confocal (Tablade materiales)con lente óptica de aumento de aceite de 40x a un tamaño de paso de 1 m o un zoom de 20x 2x a 1 m.
NOTA: El aumento de aceite de 40x dará una mayor resolución, pero tomará más tiempo que el zoom de 20x 2x. - Establezca la lente objetivo en 40x y luego haga clic en la pestaña localizar en la esquina superior izquierda en el software confocal (Tabla de materiales) y establezca la sección DG deseada en el centro del campo de visión.
- Busque DG, cambie a la pestaña de adquisición en la esquina superior izquierda y marque las siguientes casillas: Z-stack, tile-scany position.
- Establezca los ajustes del canal entre 600 y 750, una intensidad de láser del 1% y un 1% y un desplazamiento de 1 a 10. No exceda el 20% de intensidad láser para ninguno de los canales. Asegúrese de que ningún píxel esté sobresaturado al establecer la ganancia y la intensidad.
NOTA: Estos rangos variarán dependiendo de la eficiencia del equipo utilizado y de la eficiencia de tinción. - Establezca los mosaicos en 7 horizontales por 3 verticales en la ventana de escaneo de teselas y pulse la imagen de vista general del escaneo utilizando los mismos ajustes que los que se utilizan actualmente. Por ejemplo, utilice 7 horizontal por 3 vertical y el objetivo 20x con zoom 2x.
- Asegúrese de que la DG esté completamente dentro de la imagen esperada después del análisis de visión general. Si no es así, ajuste la vista de la DG hasta que esté completamente en la imagen de resumen, ya que se trata de una imagen representativa que se va a obtener.
- Establezca la profundidad de la imagen desplazándose a través de diferentes pilas Z utilizando la perilla de enfoque fino. Asegúrese de que toda la DG está dentro de los puntos inicial y final. Suponiendo un tamaño de paso de 1 m, cada imagen debe ser de aproximadamente 40 pasos.
- Establezca la velocidad de escaneo en 9 con escaneo bidireccional y sin promediación en la ventana del modo de adquisición. A continuación, añada posición en la ventana de posición.
NOTA: Repita los pasos 6.3 a 6.8 para crear una imagen de varias tarjetas de trabajo a la vez. Aumentar la velocidad de escaneo reduce la calidad de la imagen, pero reduce el tiempo general de imagen. Si la calidad de la imagen es demasiado baja, reduzca la velocidad de escaneado o aumente el promedio. - Haga clic en el botón Iniciar experimento cuando esté listo. Escanee 5 secciones de DG por ratón a lo largo del eje anterior a posterior. Por ejemplo, si la DG izquierda se muestra para la sección uno, idee la siguiente DG izquierda posterior para la sección dos.
- Coser imágenes separadas para formar una imagen completa del gyrus dentado utilizando la función de puntada debajo de la pestaña de proceso en el software confocal. Alternativamente, utilice FIJI (ImageJ) para unir imágenes para formar un giso dentado completo.
- Guarde las imágenes cosidas para la cuantificación.
7. Análisis de imágenes
- Abra cada imagen de cada sección de gyrus dentalado utilizando FIJI como proyección máxima y como imagen compuesta con los canales fusionados en colores distintos para visualizar fácilmente la colocalización.
- Mida el área de DG para cada sección de la imagen de proyección máxima utilizando la herramienta de selección de polígonos (tercer cuadro de la izquierda) y registre para cada sección de cada ratón. Este será el área de DG utilizada para calcular la densidad.
- Registre el número de celdas en DG desde la imagen compuesta que tienen anticuerpos primarios colocalizando (es decir, nestin) y el edu analógico de timidina, utilizando el contador de celdas del plugin FIJI que se encuentra en plugins analizar el contadorde células . Además, registre el número total de células positivas Edu y nestin con un proceso radial.
NOTA: En el caso de la nestina, es muy importante prestar atención a la morfología. Si cuantifica las células madre neurales, asegúrese de que sólo se cuantifiquen las células con un proceso radial. Al cuantificar las secciones de giso sorteado, aplique los mismos criterios a todos, especialmente al visualizar celdas fuera de un plano focal. Si las celdas no están dentro del plano focal, no las cuente. Por favor, consulte West et al.21 para obtener instrucciones más detalladas sobre la cuantificación estereológica. - Introduzca los recuentos de celdas en un software de hoja de cálculo para compilar todos los datos para su análisis posterior.
- Calcular la densidad de celdas colocalizadas para cada sección dividiendo el número total de células colocalizadas por el volumen total de cada sección en cada animal. Por ejemplo, obtenga la densidad de células madre dividiendo la suma de células nestin+/edu+ en un animal por la suma del volumen DG en un animal. Calcule el volumen de cada sección multiplicando el área con incrementos totales del paso Z asumiendo que cada paso es de 1 m.
NOTA: En este protocolo, los pasos totales deben ser cercanos a 40, ya que el tejido se secciona a 40 m. Asegúrese de que cada animal es un punto de datos ya que el objetivo de este enfoque es estimar la cantidad total de células colocalizadas en un hemisferio de un hipocampo. - Realice cálculos necesarios adicionales para la pregunta que uno está tratando de abordar. En este ejemplo, calcule el número total de células proliferantes, la población total de células madre y el porcentaje de células madre proliferantes después de estimular las células musgosas contralaterales.
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Resultados
Siguiendo los procedimientos experimentales descritos anteriormente (Figura1A,B), pudimos determinar los efectos de estimular las proyecciones celulares musgosas contralaterales en el nicho neurogénico dentro del hipocampo. Mediante la utilización de un virus DREADD estimulante dependiente de Cre-dependiente gq emparejado con un etiquetado de células musgosas 5-HT2A Cre-line, pudimos activar selectivamente proyecciones excitatorias de células musgosas en la DG contralateral ...
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Discusión
El objetivo de este protocolo es evaluar cómo la manipulación de circuitos neuronales específicos regula la neurogénesis hipocampal en adultos in vivo utilizando una serie de técnicas de inmunohistoquímica. Decir regulación dependiente de la actividad de la neurogénesis adulta mediada por circuitos neuronales específicos es una técnica valiosa con gran potencial para modificaciones para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, incluyendo la adm...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
L.J.Q. fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo suplemento de diversidad R01MH111773, así como una beca de capacitación T32TS07431-20. Este proyecto fue apoyado por subvenciones otorgadas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160 y NS104530).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 24 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Placa de 48 pocillos | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-etinil-2'-desoxiuridina (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| alcohol 70% isopropílico | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Almohadillas de preparación de alcohol | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Cabra DCX | Santa Cruz | Gato# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Ratón Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Solución de Betadine (povidona yodada) | Stock de ácido cítrico amazónico | ||
| [.1M] Ácido cítrico (21 g / L de ácido cítrico) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapina N- Óxido | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Software Confocal (Zen Black) | Microscopía Zeiss | Zen 2.3 SP1 FP1 (negro) | |
| Pentahidrato | Thermo Fisher Scientific AC197722500 | ||
| Hisopos de algodón | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Toallita para tareas delicadas Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Broca 0,5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Etilenglicol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Aguja Hamilton 2 pulgadas | Compañía Hmailton | 7803-05 | |
| Jeringa Hamilton 5 μ L Modelo 75 RN | Hmailton Referencia de la empresa | : 87931 | |
| Taladro de alta velocidad | Foredom | 1474 | |
| Bomba de infusión | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Solución salina inyectable | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Jeringa de insulina | BD Jeringas de insulina ultrafinas | ||
| Isoflurano | Henry Schein | 29405 | |
| Estereotax para pequeños animales | KOPF Instruments Modelo | 942 | |
| Leica M80 | Leica Leica | ||
| Microtomo Leica | SM2010 R | ||
| LSM 780 | Zeiss Microscopía | ||
| Nair (Producto de depilación) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | ||
| Plus Portaobjetos cargados | Denville Scientific | M1021 | |
| Solución tamponada de fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Opomada | Puralube | ||
| Portaobjetos 20 unidad de portaobjetos | Electrónica Microscopía Ciencia | 70312-24 | |
| Portaobjetos Soporte de portaobjetos | Ciencia de la Microscopía Electrónica | 70312-25 | |
| Almohadilla térmica para animales pequeños | K& H | ||
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pluma punta de 4 mm | PolySciences | 24230 | |
| Bisturí quirúrgico | MedPride | 47121 | |
| Tris Solución tamponada (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Caldo de citrato trisódico [0,1 M] Citrato trisódico (29,4 g/L citrato trisódico) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Pinzas | Amazon | ||
| Vet Bond Adhesivo para tejidos | 3M | 1469SB |
Referencias
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