Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Lidia Tagliafierro; Ekaterina Ilich; Malik Moncalvo; Jeffrey Gu; Ahila Sriskanda; Carole Grenier; Susan  K. Murphy; Ornit Chiba-Falek; Boris Kantor

doi:10.3791/59241

Artículo de método

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

DOI:

10.3791/59241

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29 de marzo de 2019

Lidia Tagliafierro¹^,² , Ekaterina Ilich³ , Malik Moncalvo³ , Jeffrey Gu¹ , Ahila Sriskanda¹^,² , Carole Grenier⁴ , Susan K. Murphy⁴ , Ornit Chiba-Falek¹^,² , Boris Kantor³

¹Department of Neurology, Duke University Medical Center, ²Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, ³Viral Vector Core, Duke University Medical Center, ⁴Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

En este artículo

Resumen

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A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Resumen

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El uso de células derivadas de hiPSC representa un valioso enfoque para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSCs derivada de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del gene (SNCA) de alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson (EP)-las poblaciones neuronales dopaminérgicas pertinentes. La acumulación de pruebas ha demostrado que altos niveles de SNCA son causales para el desarrollo de PD. Reconociendo la insatisfecha necesita establecer nuevos enfoques terapéuticos para la EP, especialmente aquellos dirigidos a la regulación de la expresión del SNCA , recientemente desarrolló un sistema CRISPR/dCas9-metilación-basado en el ADN para modular epigenéticamente SNCA transcripción por enriquecer los niveles de metilación en la región reguladora del intrón 1 de SNCA . Para entregar el sistema, que consta de un muerto (desactivado) versión de Cas9 (dCas9) fusionado con el dominio catalítico de la 3A de enzima metiltransferasa de ADN (DNMT3A), se utiliza un vector lentivirales. Este sistema se aplica a las células con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y reduce los niveles de proteína y SNCA-mRNA por cerca de 30% a través de la metilación del ADN específica del SNCA intrón 1. El downregulation del afinado de los niveles SNCA rescata fenotipos celulares relacionados con la enfermedad. En el protocolo actual, nuestro objetivo es describir un procedimiento paso a paso para diferenciarse hiPSCs en células progenitoras neurales (NPCs) y el establecimiento y validación de los análisis de Pirosecuenciación para la evaluación del perfil de metilación en el SNCA intrón 1. Para describir más detalladamente el sistema de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizado en estos experimentos, este protocolo describe cómo producir, purificar y concentrar vectores lentivirales y destacar su idoneidad para aplicaciones de edición de genoma y epigenoma utilizando hiPSCs y NPCs. El protocolo es fácilmente adaptable y puede utilizarse para producir lentivirus de alto título para aplicaciones in vitro e in vivo.

Introducción

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Múltiples plataformas de edición de epigenoma han desarrollado recientemente para cualquier secuencia de ADN en las regiones que controlan la expresión de gene¹^,². Las herramientas de edición de epigenoma creadas están diseñadas para (i) regular la transcripción, (ii) alterar modificaciones post-traduccionales de las histonas, (iii) modificar la metilación del ADN y (iv) modular las interacciones del elemento regulador. El enfoque para la fijación de los modificadores de la transcripción de la cromatina a un Cas9 desactivados (muertos) (dCas9) levantado de previamente desarrolladas plataformas de edición de ep....

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Protocolo

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1. diseño y producción de Virus

Construcción y diseño de plásmido
Nota: La construcción de un vector de LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one se realiza utilizando una producción- y optimizado de expresión expresión casete publicada por Ortinski et al.³⁰. El cassette de vector lleva una repetición del sitio de reconocimiento del factor de transcripción Sp1 y una canceladura de vanguardia dentro del sin traducir (U3') región de una repetición terminal 3'-larga (LTR) (figura 2A)³⁰^,³⁶. La columna vertebral del vector se....

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Resultados

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Validación de los títulos de la producción de los vectores de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro en comparación con las contrapartes GFP de ingenuo

Realizamos p24^gag ELISA para comparar entre títulos físicos de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro con las contrapartes GFP/Puro ingenuo. Resultados representativos, presentados en la figura 5A, demuestran que los rendimientos físicos de los vecto.......

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Discusión

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LVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección para la edición de epigenoma, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido principalmente a su capacidad para (i) grandes cargas útiles de DNA y (ii) transducen eficazmente una amplia gama de dividir y células nondividing. La eficacia de empaquetado grande de las LVs es especialmente beneficiosa para las aplicaciones de embalaje de los sistemas CRISPR/dCas9 que son de gran tamaño. Desde esta perspectiva, LVs representan la plataforma de elección p.......

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Divulgaciones

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Universidad de Duke presentó una solicitud de patente provisional relacionada con este estudio.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado en parte por el Kahn Neurotecnología desarrollo Premio (C.O.), institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) (NS085011 R01 para C.O.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Optima XPN-80 Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A99839
0.22 μ Unidad de filtro M, 1 L	Corning	430513
0,45-μ m unidad de filtro, 500 mL	Corning	430773
placa de cultivo tratada con TC de 100 mm	Corning	430167
tubos de centrífuga cónicos de 15 mL	Corning	430791
150 mm con tratamiento TC Placas de cultivo con rejilla de 20 mm Corning		353025
tubos de centrífuga cónicos de 50 mL
Corning	Corning	3516
Aggrewell 800	StemCell Technologies	34811
Allegra 25R centrífuga de sobremesa	Beckman Coulter	369434
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Tubos de ultracentrifugación de fondo cónico	Seton Scientific	5067
Adaptadores de tubo cónico	Seton Scientific	PN 4230
Portaobjetos de Eppendorf para la obtención de imágenes celulares	Eppendorf	30742060
Placas de alta ligereza de 96 pocillos	Microscopio	3366
	Leica	DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)	Qiagen	27104
Colador reversible	StemCell Technologies	27215
Rotor SW32Ti	Beckman Coulter	369650
VWR® Pipetas serológicas desechables, de vidrio, no pirogénicas	VWR	93000-694
VWR® Sistemas de filtración al vacío	VWR	89220-694
xMark™ Microplaca Lector de placas de absorbancia	Bio-Rad	1681150
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos de cultivo celular
Riñón embrionario humano 293T (HEK 293T)	células ATCC	CRL-3216
Accutase	StemCell Technologies	7920
Solución de enjuague antiadherente	StemCell Technologies	7010
Anticuerpo Anti-FOXA2	Abcam	Ab60721
Anticuerpo Anti-Nestina	Abcam	Ab18102
Solución antibiótica-antimicótica, 100x	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Suplemento de B-27 (50x), sin vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
BES	Sigma Aldrich	B9879 - BES
7,5%)	Thermo Fisher Scientific	15260037
CHIR99021	StemCell Technologies	72052
Corning Matrigel Matriz calificada por hESC Corning		08-774-552
Suero de becerro cósmico	Hyclone	SH30087.04
DMEM-F12	Lonza	12-719
DMEM, medios de alta glucosa	Gibco	11965
DNeasy Blood & Kit de tejido	Qiagen	69504
EpiTect PCR Control DNA Set	Qiagen	596945
EZ DNA Kit de metilación	Zymo Research	D5001
Gelatina	Sigma Aldrich	G1800-100G
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15750078
Reactivo de disociación celular suave	Tecnologías Stem Cell	7174
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Recombinante Humano bFGF	StemCell Technologies	78003
Recombinante Humano EGF	StemCell Technologies	78006
Shh recombinante humano (C24II)	StemCell Technologies	78065
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
mTeSR1	StemCell Technologies	85850
N-2 Suplemento (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Medio neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049
aminoácido no esencial (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
PyroMark PCR Kit	Qiagen	978703
RPMI 1640 medios	Thermo Fisher Scientific	11875-085
SB431542	StemCell Technologies	72232
Piruvato	de sodioSigma Aldrich	S8636-100ML
STEMdiff medio de inducción neuronal	StemCell Technologies	5835
STEMdiff Medio de congelación de progenitores neurales	StemCell Technologies	5838
Ensayo TaqMan FOXA2	Thermo Fisher Scientific	Hs00232764
Ensayo TaqMan GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs99999905
Ensayo TaqMan Nestin	Thermo Fisher Scientific	Hs04187831
Ensayo TaqMan OCT4	Thermo Fisher Scientific	Hs04260367
Ensayo TaqMan PPIA	Thermo Fisher Scientific	Hs99999904
Tripsina-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
Y27632	Tecnologías de células madre	72302
Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comments
p²⁴ reactivos ELISA
Anticuerpo monoclonal anti-p²⁴	Programa de reactivos de investigación y referencia del SIDA de los NIH	3537
Peroxidasa de rábano picante anti-conejo de cabra IgG Sigma	Aldrich	12-348	Concentración de trabajo 1:1500
Suero de cabra, estéril, 10 mL	Sigma	G9023	Concentración de trabajo 1:1000
Estándares de VIH-1	Programa de reactivos de referencia e investigación sobre el SIDA de los NIH	SP968F
Suero normal para ratón, estéril, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Anticuerpo policlonal de conejo anti-p²⁴	Programa de reactivos de referencia e investigación sobre el SIDA de los NIH	SP451T
Sustrato de peroxidasa TMB	KPL	5120-0076	Concentración de trabajo 1:10,000
Nombre	Empresa	Número de catálogo	>Comentarios
Plásmidos
pMD2.G	Addgene	12253
pRSV-Rev	Addgene	52961
psPAX2	Addgene	12259
Name	>Company	Número de catálogo	Comments
Enzimas de restricción
BsmBI	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0580S
BsrGI	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0575S
EcoRV	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0195S
KpnI	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0142S
PacI	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0547S
SphI	Biolabs de Nueva Inglaterra	R0182S

Placas de 6 pocillos de 430291 de fluorescencia invertida Corning Fracción V de albúmina bovina (solución al

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology<....

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Producci n de vectores lentivirales diferenciaci n de hiPSC sistema CRISPR dCas9 an lisis de metilaci n de SNCA modelos de neuronas dopamin rgicas ensayo de pirosecuenciaci n purificaci n de vectores virales c lulas madre pluripotentes inducidas humanas modelos de la enfermedad de Parkinson

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