Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Resumen

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Resumen

El control genético de la citoarquitectura neuronal es actualmente objeto de una investigación intensiva. Aquí se describe un método simple desarrollado para estudiar el control del gen in vivo de la morfología de la neurona de proyección neocortical. Este método se basa en (1) la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales como células de "prueba" y "control", (2) su cotrasplante en cerebros de tipo salvaje, y (3) la evaluación morfométrica emparejada de sus derivados neuronales. Específicamente, e12.5 precursores palliales de panneuronal, donantes genéticamente etiquetados, se emplean para este propósito. Están diseñados para aprovechar los promotores seleccionados y la tecnología tetON/OFF, y se trasplantan a mano alzada en ventrículos laterales neonatales. Más tarde, tras el perfil de inmunofluorescencia de los cerebros receptores, las siluetas de las neuronas trasplantadas se introducen en el software de código abierto NeurphologyJ, se extraen sus parámetros morfométricos y se calculan la longitud media y el índice de ramificación. En comparación con otros métodos, este ofrece tres ventajas principales: permite lograr un control fino de la expresión transgénica a costos asequibles, sólo requiere habilidades quirúrgicas básicas, y proporciona resultados estadísticamente confiables tras el análisis de una número de animales. Debido a su diseño, sin embargo, no es adecuado para abordar el control no autónomo celular de la neuroarquitectura. Además, se debe utilizar preferentemente para investigar el control morfológico de neurita después de la finalización de la migración neuronal. En su formulación actual, este método está exquisitamente ajustado para investigar el control genético de la arquitectura de neuronas neocorticales glutamatérgicas. Aprovechando las líneas transgénicas que expresan EGFP en otros tipos específicos de células neurales, se puede reutilizar para abordar el control genético de su arquitectura.

Introducción

Aquí describimos un método simple que desarrollamos para diseccionar el control genético in vivo de la citoarquitectura neuronal. Basado en la ingeniería in vitro de precursores neuronales, su trasplante en cerebro neonatal y evaluación morfométrica emparejada de células de "prueba" y "control", permite revelar implicaciones funcionales de genes de prueba en el control fino de la morfología neuronal en un manera rápida y asequible. Para investigar el control genético in vivo de la arquitectura neuronal, deben abordarse tres cuestiones técnicas clave: 1) lograr una expresión genética de interés (GOI) adecuadamente modelada y un control cuantitativo preciso de la misma;....

Protocolo

Todos los métodos y procedimientos descritos aquí han sido aprobados por la SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).

1. Generación de piscinas de progenitores "verdes" de ingeniería

1. Preparación de la piscina "verde"
   1. Mate una hembra de CD1 de tipo salvaje con un fundador de Mtapt^{EGFP/+ 16}. Eutanasia la presa embarazada por luxación cervical a los 12,5 días después del coíto (el día 0 se determina mediante la inspección del tapón vaginal) y cosechar los embriones embrionarios del día 12,5 (E12.5). Establézcalos en pozos individuales de una pl....

Resultados

Existen cinco conjuntos de datos principales que proporcionan información útil sobre aspectos clave del procedimiento, siendo el primero (1) la eficiencia de la transducción de precursores neuronales y la co-transducción por vectores lentivirales. (2) Un ejemplo de las características clave de los promotores empleados para impulsar el "gen de prueba". (3) Un ejemplo de células de ingeniería listas para el trasplante. (4) Una caricatura que incluye los detalles procesales clave de la micro.......

Discusión

Los aspectos/pasos específicos de este procedimiento son críticos y requieren una atención especial. En primer lugar, (a) los operadores deben estar adecuadamente preparados para manipular de forma segura los lentivirus en un entorno de laboratorio compatible con BSL-2. En segundo lugar, b) antes de mezclar las preparaciones neuronales de "prueba" y "control", es obligatorio lavar cuidadosamente las dos suspensiones de neuroesfera correspondientes como se describe, con el fin de prevenir cualquier infección cruzada retra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 0,3 mL	BD	320840	tienda a RT
0,45 μ m filtro estéril	Millex-HV		SLHU033RS tienda en RT
12 placa multipocillo	Tienda Falcon		353043 en RT
1X PBS	Tienda Gibco	14190-094	en RT
24 placa multipocillo	Tienda Falcon	351147	en RT
anticuerpo anti-EGFP, pollo policlonal, RRID:AB_371416	Tebubio		GTX13970 tienda en -20 ° Anticuerpo
anti-RFP C, monoclonal de rata, RRID:AB_10795839	Anticuerpos en línea	ABIN334653	tienda en -20 ° Anticuerpo C
anti-Tubb3, monoclonal de ratón, RRID:AB_2313773	MMS-435P	Covance	en -20 ° C
Kit de conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas	Tienda Sigma	A5177-5EA	en RT
Lámpara de luz azul	Nightsea	Tienda BLS2	en RT
Capilares de borosilicato	Tienda Kwik-Fil	TW150-4	en RT
Tienda BSA	Sigma	A9647	en -20 ° C
Bü cámara rker	Sigma	BR719520	0.0025 mm2, 0.100 mm
Medio de crioinclusión (Killik)	Bio-Optica	05-9801	tienda RT
DAPI	Sigma	D9542	en -20 ° C
Molde de inclusión desechable	Bio-Optica	07MP7070	tienda en la tienda RT
DMEM/F-12	Gibco	31331-028	en +4 ° C
Dnase I	Roche	10104159001	tienda en -20 ° Tienda C
Doxycicline	Sigma	D1822	en -20 ° C
Pinzas Dumont #3c	tienda Fine Science Tools	11231-20	en RT
Pinzas Dumont #5	Tienda Fine Science Tools	11251-20	en RT
EGF	Tienda Gibco	PHG0311	en -20 ° Tienda C
EGTA	Sigma	E3889	en RT
FGF	Gibco	PHG0261	tienda en -20 ° C
Tijeras finas - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	tienda en RT
Fungizone (Anfotericina B)	Gibco	15290018	tienda en -20 ° Tienda C
Glucose	Sigma	G8270	en RT
GlutaMAX Supplement	Gibco		35050061 tienda en RT
Cabra anti-pollo Alexa 488	Invitrogen	A11039	tienda en -20 ° C
Cabra anti-rata Alexa 594	Invitrogen	A11007	tienda en -20 ° C
Solución de heparina	Stem Cell Technologies	07980	tienda en -20 ° C
N2 Suplemento	Gibco	17502048	tienda en -20 ° C
Fibras ópticas	Leica	CLS150X
P1000 tirador	Sutter Instruments	P-1000 modelo
Parafilm	Bemis	PM-996	tienda en RT
Pen Strep	Sigma	P0781	tienda en -20 ° C
Placa de Petri	Falcon	353003	tienda en RT
	PFA Sigma	158127	tienda en RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]	construido en casa		store en -20 ° C
Plásmido #386 [LV_pTa1_mCherry]	construido in house		store en -20 °
C Plásmido #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]	construido en la tienda house		store en -20 °
C Plásmido #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]	construido en casa		store en -20 °
C Plásmido #484 [LV_lacZ]	Addgene	12108	tienda en -20 ° C
Plásmido #529 [LV_Pgk1p_mCherry]	construido en casa		store en -20 °
C Plásmido #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]	construido in house		store en -20 °
C Bisturí	Braun	BB515	tienda en RT
Steromicroscope	Leica	MZ6	tienda en RT
Trypan azul	Gibco	15250-061	tienda en RT
Trypsin	Gibco	15400-054	tienda en -20 ° C
Inhibidor de tripsina	Sigma	T6522	almacene en -20 ° C

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