Natación por parálisis (SWIP) es un ensayo de comportamiento bien establecido utilizado para estudiar los mecanismos subyacentes de la dopamina en Caenorhabditis elegans (C. elegans). Sin embargo, carece de un método detallado para llevar a cabo el ensayo. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para SWIP.
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Artículo de método
Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans
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Resumen
Resumen
El ensayo de natación se describe en este protocolo es una herramienta válida para identificar proteínas regulan el dopaminérgico sinapsis. Similar a los mamíferos, dopamina (DA) controla varias funciones en C. elegans como actividad de aprendizaje y motor. Condiciones que estimulan la liberación de DA (p. ej., tratamientos de anfetamina (AMPH)) o que evitar separación de DA (por ejemplo, animales que carecen del transportador de DA (dat-1) que son incapaces de reaccumulating DA en las neuronas) generan un exceso de DA extracelular en última instancia dando por resultado locomoción inhibido. Este comportamiento es particularmente evidente cuando los animales nadan en el agua. De hecho, mientras animales de tipo silvestre a nadar durante un largo período, mutantes nulos dat-1 y tipo salvaje trataron con AMPH o inhibidores del transportador de DA se hunden hasta el fondo del pozo y no se mueven. Este comportamiento se denomina "Parálisis inducida de natación" (SWIP). Aunque está bien establecido el ensayo SWIP, carece de una descripción detallada del método. Aquí, describimos una guía paso a paso para realizar SWIP. Para realizar el ensayo, último larvales etapa 4 animales se colocan en una placa de punto de cristal que contiene control de solución de sacarosa con o sin AMPH. Animales son marcados por su comportamiento de natación ya sea manualmente por visualización bajo un estereoscopio o automáticamente por la grabación con una cámara montada en el estereoscopio. Videos entonces se analizan utilizando un software de seguimiento, que produce una representación visual de frecuencia de golpear y de parálisis en forma de mapas de calor. Los sistemas manuales y automatizados garantizan una lectura fácilmente cuantificable de la capacidad de natación de los animales y facilitan así la detección de animales con mutaciones en el sistema dopaminérgico o para genes auxiliares. Además, SWIP puede utilizarse para aclarar el mecanismo de acción de drogas de abuso como AMPH.
Introducción
Los animales realizan una variedad de comportamientos innatos y complejas que están mediadas por diferentes neurotransmisores coordinados por intrincados procesos de señalización. El neurotransmisor dopamina (DA) media comportamientos altamente conservados entre especies, incluyendo el aprendizaje, la función motora y procesamiento de la recompensa.
C. elegans, los nematodos del suelo con un sistema nervioso relativamente simple y bien asignado, que consta de sólo 302 neuronas, muestra comportamientos notablemente complejos, incluyendo muchos que son reguladas por DA como acoplamiento, aprendizaje, alimentación, locomoción y puesta de huevos 1. entre otras características, ciclo de vida corto, facilidad de manejo y la conservación de moléculas señalizadoras, destacar las ventajas del uso de C. elegans como modelo para estudiar la base neural de conductas conservadas.
El hermafrodita C. elegans contiene ocho neuronas dopaminérgicas; Además de éstos, el hombre contiene seis pares extras para fines de apareamiento. Como en mamíferos, estas neuronas sintetizan DA y expresan el DA transportador (DAT-1), una proteína de membrana que se encuentra exclusivamente en las neuronas dopaminérgicas, que transporta DA liberada en la hendidura sináptica en las neuronas dopaminérgicas. Además, la mayoría de las proteínas implicadas en cada paso de la síntesis, empaque y liberación de DA está muy conservada entre los gusanos y los seres humanos y, como en los mamíferos DA modula la alimentación comportamientos y locomoción en C. elegans2.
C. elegans se arrastra en las superficies sólidas y nada con un comportamiento característico de golpear en el agua. Curiosamente, mutantes que carecen de expresión del DAT-1 (dat-1) gatear normalmente sobre una superficie sólida pero incapaces de sostener la natación cuando sumergido en el agua. Este comportamiento se denomina natación inducida por parálisis o SWIP. Experimentos anteriores demostraron que SWIP, en parte, es causada por un exceso de DA en la hendidura sináptica que en última instancia estimula los receptores postsinápticos D2-like (DOP-3). Aunque originalmente identificado en el dat-1 nocaut animales3, SWIP también se observa en animales de tipo silvestre tratados con fármacos que bloquean la actividad de DAT (p. ej., imipramina4) o inducir la liberación de DA (p. ej., anfetamina,5). Por otro lado, manipulaciones farmacológicas o genéticas evitando la síntesis y liberación de DA y el bloqueo de función de receptor DOP-3 previenen SWIP6. Tomados en conjunto, estos datos ya publicados han establecido SWIP como herramienta fiable para estudiar los efectos conductuales causados por las proteínas mutadas en dopaminérgicos sinapsis3,4,7 y ser empleado para adelante pantallas genéticas para la identificación de nuevos vías reguladoras implicadas en DA señalización7,8,9,10,11,12. Además, al proporcionar una lectura fácilmente cuantificable del comportamiento droga-inducida en animales vivos, SWIP permite la elucidación de mecanismos de acción de drogas como la anfetamina (AMPH) y azaperone en el dopaminérgico sinapsis5, 6 , 13 , 14 , 15.
Se han descrito protocolos para realizar los ensayos SWIP antes16. Aquí, describimos en detalle la metodología y la instalación para realizar el ensayo con el objetivo de proporcionar a una guía visual para la comunidad de C. elegans para efectivamente realizar SWIP.
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Protocolo
1. preparación de soluciones y medios de comunicación
- Preparación de buffer M9 por disolución de KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) y NaCl 5.0 g (85,5 mM) en 1 L de agua desionizada en autoclave. Añadir 1,0 mL de 1 M MgSO4 (12 g en un volumen final de 100 mL de agua desionizada en autoclave) después de la esterilización en autoclave. Mezcla 100 mL de la resultante x 10 M9 con 900 mL de autoclave desionizada para hacer una solución de 1 x.
- Para hacer el tampón de huevo, disolver 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g de MgCl2-6 H2O (2 mM) y 5,958 g (25 mM) de HEPES en 1 L de agua desionizada en autoclave. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH.
- Preparar solución fresca hipoclorito de sodio/NaOH añadiendo 1 mL de 5-6% hipoclorito sódico (lejía) y 180 μl de NaOH N 10 a 3,8 mL de agua desionizada.
- Peso sacarosa 60 g y disolver en agua desionizada en autoclave hasta un volumen final de 100 mL solución de sacarosa 60%.
- Disolver 0,684 g de sacarosa en 10 mL de agua desionizada en autoclave para hacer sacarosa 200 mM. Comprobar y ajustar a la misma una osmolaridad con osmómetro. Alícuotas de 1 mL en 1.5 mL tubos de microcentrífuga y congelar a-20 ° C.
- Pesar, 0,184 g de AMPH (peso molecular 184.75 g/mol) y disolver en 10 mL de agua desionizada para hacer una solución stock de 100 mM. Mezcle 2 μl de la solución madre en 400 μL de agua para hacer la solución de trabajo de 0.5 milímetros.
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Preparar nutrientes crecimiento las placas de los medios de comunicación (NGM)
- Mezclar 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptona, 25 g de bacto-agar y 975 mL de agua desionizada en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Incluyen una barra de agitación magnética y autoclave (121 ° C, 15 PSI) durante 1 hora con ciclo de líquidos.
- Enfriar y mantener la temperatura a unos 50 º C colocando el matraz en una estufa mientras revuelve. Agregar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol) 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2 y 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 7.4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g de K2HPO4 agua a 1 L).
- Pipetear 25 mL en placas de Petri 100 x 15 mm y permitir que los medios de comunicación que se solidifique. Almacenar las placas boca abajo a 4 ° C en una caja hasta por 4 semanas.
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Preparación de caldo de lisogenia (LB)
- Disolver 5 g de mezcla de polvo LB en 200 mL de agua desionizada en un matraz Erlenmeyer. Ciclo de autoclave durante 30 minutos utilizando la esterilización de líquidos. Deje que el caldo se enfríe. Almacenar a temperatura ambiente durante 1-2 semanas.
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Preparación de placas bacterianas NA22
- Utilizar una pipeta estéril o un bucle bacteriano estéril a raya una placa LB con un pequeño volumen de NA22 e. coli bacteria de la acción de glicerol e Incube la placa boca abajo en una incubadora de 37 ° C durante la noche para hacer crecer colonias aisladas. Recoger e introducir una sola Colonia de 200 mL de LB caldo preparado en el paso 1.8 y dejar crecer durante la noche a 37 ° C sobre una plataforma de agitación.
- Para las placas de la semilla, dispensar 200 μL de cultivo bacteriano en las placas NGM preparado anteriormente en el paso 1.7 y extender con un palo de hockey de vidrio estéril. Deje las placas secar durante la noche o ya bajo una campana y guardar boca abajo en una caja hermética a 4 ° C.
- Para hacer que la herramienta de pestañas/platino para recoger gusanos, pegar una pestaña gruesa o un filamento de platino en un vaso de Pasteur pipeta usando pegamento. Corta la punta de la pestaña en un ángulo con una cuchilla de afeitar. Alternativamente, puede utilizarse un quemador Bunsen para derretir la punta de la pipeta de vidrio alrededor del filamento de platino.
2. cría de C. elegans
Nota: Cultura de tipo salvaje N2C. elegans cepa de Escherichia coli NA22 placas. A continuación se describen los métodos de toda cultura
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Preparación de cultivo de gusano
- Para hacer una cultura de arrancador de gusanos, cortar un pequeño trozo de agar de una placa que contiene animales bien alimentados y transferirlo sobre una placa de bacterias NA22 e. coli preparada en el paso 1.9 con una espátula estéril. Incubar las placas a 20 ° C durante 3-4 días. Microscopio estéreo, confirmar visualmente la presencia de adultos grávidas.
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Preparación de población sincronizada de gusanos
- Recoger a adultos grávidos de al menos 2 placas por agua desionizada esterilizado alrededor de la placa con una botella de squirt. Agitar suavemente la placa para desalojar a los gusanos y recoger los gusanos en un tubo cónico de 15 mL poliestireno, utilizando una pipeta de plástico desechable.
- Girar hacia abajo el tubo de la centrífuga a 140 x g durante 2 min para los gusanos de la pelotilla, y luego aspirar apagado sobrenadante usando una bomba de vacío o con construido en vacío de laboratorio.
- Resuspender y lavado los gusanos llenando el tubo con agua desionizada esterilizado y mezcle y centrifugue a 140 x g durante 2 minutos, aspiración el sobrenadante y repetición este último paso dos veces más o hasta que los gusanos son claros de bacterias (agua aparece claro cuando se mezclan con los gusanos).
- Añadir 5 mL de solución de hipoclorito sódico recién hechas/NaOH (paso 1.3) a la pelotilla de gusano y rápidamente mezclar con un vórtex. Incubar el tubo en un eje de balancín para unos 4-8 minutos. El tiempo de incubación con solución de hipoclorito de sodio/NaOH oscila entre 4-8 minutos basadas en la calidad de la solución stock de hipoclorito sódico (lejía).
- Poner una gota (2-50 μL) de solución que contiene gusanos en un portaobjeto de microscopio y comprobar cada 2 min bajo el microscopio para lisis de gusano. Cuando alrededor del 70% de los gusanos son lisis y se liberan huevos, llenar el tubo con tampón de huevo preparado en el paso 1.2 y centrifugar inmediatamente durante 1 min a x 140 g a los embriones de la pelotilla y gusano de cadáveres.
- Aspirar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces más llenando cada vez que el tubo con tampón de huevo. Desactivación a 140 x g durante 1 minuto y retire el sobrenadante de cada vez. El pellet se pone blanco al final del lavado.
- Después del último lavado, separar los embriones de las reses muertas en solución de sacarosa al 30%. Añadir 5 mL de agua desionizada en autoclave a la pelotilla, resuspender y añadir 5 mL de sacarosa al 60% preparado en el paso 1.4. Mezcle bien y centrifugue a x 160 g durante 6 minutos.
- Utilizar un pipeta Pasteur de vidrio para transferir los embriones flotando en el menisco superior en un tubo cónico de 15 mL fresco. No tome más de 3-4 mL. Para eliminar cualquier resto de sacarosa, lavar los embriones 3 veces con agua esterilizada por centrifugación a 140 x g durante 3 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender el pellet (y el tubo de aspiración) cada vez.
- Repetir los lavados con tampón de x M9 1. Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 10 mL de M9. Dejar los tubos en un agitador durante la noche (no más de 14 h) para que los huevos que eclosionan en larvas L1. Gusanos se mantendrá en fase larvaria L1 debido a la falta de alimentos.
- Las larvas de la colada de la L1 3 veces con agua esterilizada para quitar cualquier pheromones lanzados por las larvas por centrifugación a 140 x g durante 2 minutos resuspender las larvas en 1 mL de agua. Hacer un 1:10 dilución de los gusanos en el agua, pipeta una gota de 10 μL en un portaobjeto, ponerse un cubreobjetos y contar el número de gusanos bajo un estereoscopio. Repetir esto dos veces y media los resultados.
- Pipeta el volumen de lombrices que corresponde a unos 1.000 gusanos sobre una placa de NA22 (que fue previamente llevado a temperatura ambiente) mediante la colocación de pequeñas gotas en la placa. Deje la placa entreabierta hasta que la gota se seca. Luego cubrir la placa e incubar invertida en 20 ° C la incubadora por unos 44-48 h o hasta que los gusanos alcanzan L4 tardía, según lo confirmado visualmente bajo un estereomicroscopio. Ahora los gusanos están listos para ser probado para SWIP.
3. SWIP
Nota: Describimos el método manual de evaluación de SWIP en gusanos del tipo salvaje tratados con AMPH. Discutimos también brevemente el seguimiento de los gusanos y posterior análisis de la cinética del gusano utilizando un rastreador de gusano automatizados y un software de seguimiento que fueron descritos anteriormente por Hardaway et al10.
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Método manual para probar SWIP
- Alícuota de 40 μl de solución de sacarosa de 200 mOsm/L con o sin AMPH de 0,5 mM en una placa de cristal de punto. Bajo el estereoscopio, 8-10 finales L4 etapa gusanos con una pestaña o platino pick y sumerge el pico en la placa que contiene la solución hasta gusanos mover de lo pick y nadan en la solución. Tenga en cuenta el número de gusanos recogidos en el pozo, iniciar el temporizador, observar y registrar el número de gusanos exponiendo SWIP en cada minuto marca.
- Copiar los datos en bruto en una hoja de cálculo y calcular el porcentaje de gusanos paralizados dividiendo el número de gusanos paralizados a cada minuto por número total de gusanos probados en el ensayo y multiplicar por 100. Copiar los valores de porcentaje en cualquier representación gráfica y formato de los datos con valores de porcentaje en el eje Y y tiempo en el eje mediante el gráfico XY X parcela y software estadístico.
- Realizar el ANOVA dos vías, seguido de análisis post-hoc (por ejemplo, post-test de Bonferroni) para probar para la significación estadística entre control, AMPH grupos y tiempo de tratamiento.
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Análisis automatizado de SWIP
- Realizar análisis automatizado en un solo gusano en un momento. El protocolo establecido por la cámara, el gusano tracker software y script para ejecutar el software de seguimiento análisis se describen en detalle en Hardaway et al16.
- Brevemente, coloque a solo finales L4 etapa hermafrodita en una placa de vidrio punto utilizando una selección de la pestaña, como se describe en el método manual en la sección 3.1.2. Grabar videos de natación de un gusano en el tiempo y utilizar el software de tracker de gusano para calcular la frecuencia de curvas del cuerpo.
- Siga la secuencia de comandos proporcionada con el software de seguimiento para obtener gusano golpear frecuencia y para generar mapas de calor de los datos de la paliza de gusano.
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Resultados
Presentamos un ejemplo de ensayo SWIP inducida por tratamiento AMPH. La figura 1 muestra una representación esquemática de la configuración del ensayo como se describe anteriormente. Para el análisis manual, sobre 8-10 edad sincronizado finales L4 etapa gusanos recogidos con una pestaña o platino escoger y colocar en una placa de punto de vidrio lleno con 40 μl de 200 mOsm/L sacarosa (solución de control) o sacarosa con 0.5 mM AMPH y probados para SWIP.
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Discusión
Aquí, describimos un protocolo paso a paso para realizar un ensayo conductual, SWIP, en C. elegans. Este protocolo es sencillo con no vallas técnicas principales hacer este usuario de ensayo muy amigable. Sin embargo, existen algunos aspectos críticos que deben considerarse para efectivamente llevar a cabo el ensayo.
Debe tenerse cuidado para asegurar que los gusanos que se utiliza para el análisis son bien alimentados, ya que afecta la restricción dietética SWIP17
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el Dr. Osama Refai del laboratorio del Dr. Randy Blakely de orientación con el análisis automatizado de SWIP. Este trabajo fue apoyado por fondos del NIH R01 DA042156 LC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Papel de aluminio | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Incubadora bacteriana de autoclave | |||
| New Brunswick scientific | M1352-0000 | ||
| Grado bacteriológico, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptona | BD | REF 211677 | |
| Cloruro de calcio (dihidratado) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Centrífuga Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | ||
| Colesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Agua desionizada | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q Placa puntual de |
| vidrio para depresión | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Matraz Erlenmeyer | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Pestañas | |||
| Corredera de vidrio | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Software gráfico y estadístico | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hipoclorito | Hawkins | Hipoclorito de sodio 4-6%, USP" Caldo LB de 1 galón | |
| , Miller | Fisher | BP1426 | |
| Cloruro de magnesio (hexahidratado) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Sulfato de magnesio (heptahidratado) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Barra agitadora magnética | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Tubos de microcentrífuga | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacterias | CGC | ||
| Nistatina | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmómetro | Advanced Instruments, Inc | Modelo 3320 | |
| Pasteur Pipetas | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplacas | Falcon | 351007 | |
| Medidor de pH | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Tubos cónicos de polistrina | Falcon | 352095 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Fosfato de dihidrógeno de potasio | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Fosfato de potasio - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Fosfato de potasio - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Pipetas serológicas | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Agitador Reliable Scientific | 55S 12x16 | ||
| Cloruro de sodio | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Dihidrógeno de sodio Fosfato | Fisher | RB=S381 | |
| Hoja de cálculo | MS office | Microsoft Excel | |
| Microscopio estereoscópico | Zeiss | Modelo tlb3. 1 stemi2000 | |
| Puntas de pipeta estériles | Varios | 02-707-400 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 onzas | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Software de grabación de vídeo | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referencias
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