Artículo de método

Compartmentalización de las neuronas derivadas de células madre humanas dentro de chips microfluídicos plásticos preensamblados

DOI:

10.3791/59250

⸱

3 de mayo de 2019

 ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, 2UNC/NC State Joint Department of Biomedical Engineering, 3Xona Microfluidics, LLC

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra el uso de chips microfluídicos compartimentados, moldeados por inyección en un copolímero de olefina cíclico a neuronas cultivadas diferenciadas de las células madre humanas. Estos chips son premontados y más fáciles de usar que los dispositivos tradicionales de poli(dimetilsiloxano) compartimentados. Aquí se describen múltiples paradigmas experimentales comunes, como el etiquetado viral, el aislamiento fluido, la axotomía y la inmunomancha.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de dispositivos microfluídicos para compartimentar las neuronas cultivadas se ha convertido en un método estándar en neurociencia. Este protocolo muestra cómo utilizar un chip multi-compartimento premontado hecho en un copolímero de olefina cíclico (COC) para compartimentar las neuronas diferenciadas de las células madre humanas. La huella de estos chips COC es la misma que una diapositiva de microscopio estándar y son igualmente compatibles con la microscopía de alta resolución. Las neuronas se diferencian de las células madre neuronales humanas (NSC) en neuronas glutamatérgicas dentro del chip y se mantienen durante 5 semanas, lo que permite tiempo suficiente para que estas neuronas desarrollen sinapsis y espinas dendríticas. Además, demostramos múltiples procedimientos experimentales comunes utilizando estos chips multi-compartimento, incluyendo el etiquetado viral, el establecimiento de microambientes, la axotomía y la inmunocitoquímica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las neuronas diferenciadas con células madre humanas (neuronas hSC) se utilizan cada vez más para la investigación biológica. Estas neuronas, que pueden derivarse de material de origen humano, son de gran interés para la investigación traslacional, incluyendo el estudio de lesiones cerebrales traumáticas y trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, las herramientas para mejorar y facilitar el estudio de las neuronas hSC están en demanda.

Para estudiar la morfología polarizada única de las neuronas, muchos investigadores utilizan dispositivos microfluídicos multicomparticionizados1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Estos dispositivos permiten mediciones y manipulaciones de neuronas de proyección larga con acceso subcelular único. Los dispositivos microfluídicos multicomparticionales consisten en dos compartimentos microfluídicos paralelos separados por microgrooves, que guían el crecimiento axonal. Las neuronas o células madre neurales (NSC) se nivelan en el compartimiento somatodedrítico, y luego se adhieren a la parte inferior de la superficie del compartimiento después de minutos. Las neuronas diferenciadas crecen y extienden sus axons/proyecciones a través de la región de microgroove en un compartimiento axonal adyacente y aislado. En el pasado, estos dispositivos se fabricaban exclusivamente utilizando moldeo de réplica de poli (dimethylsiloxane) (PDMS). Los dispositivos PDMS tienen muchos inconvenientes descritos anteriormente12,incluyendo la hidrofobicidad persistente y la necesidad de montar en una cubierta de vidrio inmediatamente antes de su uso. Las virutas moldeadas por inyección premontadas superan muchos de estos inconvenientes y se venden comercialmente (ver Tabla de Materiales)12. Los compartimentos de estos chips se hacen hidrófilos de forma permanente y todo el chip se moldea por inyección en copolímero de olefina cíclico (COC) ópticamente transparente.

Este protocolo demuestra cómo utilizar este chip COC para diferenciar los SCN humanos en neuronas excitatorias, y para separar y aislar fluidamente sus proyecciones neuronales largas. Para esta demostración, las neuronas se diferenciaron de las células madre H9 aprobadas por NIH. Se pueden utilizar procedimientos similares para diferenciar las células madre pluripotentes inducidas por el hombre.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La Figura 1A,B muestra un esquema del chip COC premontado, incluidas las ubicaciones de los principales canales o compartimentos, pozos y microgrooves. El chip compartimentado puede establecer microambientes fluidos distintos dentro de un compartimiento como lo demuestra el aislamiento del colorante alimentario (Figura1C). El protocolo para la preparación del chip multicompartimento premontado se indica en Nagendran et al., Sección 112.

1. Recubrimiento de chips multi-compartimento para neuronas hSC

NOTA: La Figura 2A muestra una visión general de los procedimientos de recubrimiento.

  1. Disolver la poli-L-ornitina en agua destilada de grado de cultivo celular para hacer 600 ml de solución por chip de una solución de trabajo de 20 g/ml.
  2. Aspirar el PBS restante que queda después de preparar las fichas de los pozos. Al aspirar, asegúrese de que la punta del pipeteo esté lejos de la abertura del canal.
    NOTA: Los canales microfluídicos deben permanecer llenos durante la totalidad de este procedimiento. No aspirar líquido de los canales/compartimentos, sólo los pozos.
  3. Cargar 150 l de solución de trabajo de poli-L-ornitina en el pozo superior derecho. Espere 90 s o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Añadir 150 s de medios al pozo inferior derecho y esperar 5 minutos para dejar que el líquido pase a través de las microgrooves.
  4. Añadir 150 s de medios al pozo superior izquierdo. Espere 90 s y luego agregue 150 s al pozo inferior izquierdo. Envuelva el soporte de la(s) viruta(s) con un parafilm y colóquelo a 4oC durante la noche.
    NOTA: Alternativamente, coloque el chip y el soporte a 37 oC durante 1 h.
  5. Aspirar el medio de los pozos, asegurándose de que la punta del pipeteo se coloca lejos de la abertura del canal. Añadir 150 l de agua estéril en el pozo superior derecho. Espere 90 s y luego agregue 150 s al pozo inferior derecho. Espere 5 minutos para dejar que el líquido pase a través de las microgrooves.
  6. Añadir 150 l de agua estéril en el pozo superior izquierdo, esperar 90 s y luego añadir otros 150 s al pozo inferior izquierdo.
  7. Repita los pasos 1.5-1.6.
  8. Descongelar lentamente el laminina a 2oC a 8oC y preparar una solución de trabajo de 10 g/ml.
  9. Cargue 150 l de la solución de trabajo de laminina en el pozo superior derecho. Espere 90 s o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Pipet 150 l hacia la parte inferior derecha. Espere 5 minutos para dejar que el laminin pasar a través de los microgrooves.
  10. Añadir 150 l de laminin a la parte superior izquierda del pozo. Espere 90 s y luego agregue 150 s al pozo inferior izquierdo. Incubar el chip dentro de su soporte durante 2 h a 37oC.
  11. Enjuague el chip con PBS (sin Ca2+ y Mg2+). Cargue 150 sl de PBS en el pozo superior derecho. Espere 90 s o hasta que el líquido comience a llenar el pozo inferior derecho. Agregue 150 l de PBS a la parte inferior derecha y espere 5 minutos para dejar que el PBS pase a través de los microgrooves.
  12. Pipet 150 l de PBS en el pozo superior izquierdo. Después de 90 s pipeta 150 s en el pozo inferior izquierdo.
  13. Aspirar PBS desde el chip y luego enjuagar el chip con medios NSC (ver Tabla de Materiales). Cargue 150 s de medios en el pozo superior derecho. Después de 90 s o cuando el líquido pasa a través del canal derecho en el pozo inferior derecho, agregue 150 s al pozo inferior derecho. Espere 5 minutos para dejar que los medios fluyan a través de las microgrooves.
  14. Añadir 150 s de medios en el pozo superior izquierdo y otros 150 s al pozo inferior izquierdo. Incubar el chip en una incubadora de 37oC con 5% deCO2 para preacondicionar el chip hasta que esté listo para sembrar los SIN.
    NOTA: Las fichas se pueden preacondicionar durante la noche si es necesario.

2. Sembrar Los SCN en el chip multicompartimento

NOTA: Este protocolo utiliza batutas compradas comercialmente, a diferencia de nuestra publicación anterior que comenzó con células madre embrionarias humanas5. En este protocolo las células madre neurales se chapan directamente en las virutas de plástico donde se diferencian en neuronas. Las células pueden proliferar como NSC (sin diferenciación) para hasta 2 pasajes y almacenarse en viales en líquido N2 para su uso posterior. Este protocolo utiliza viales NSC almacenados en líquido N2 después del paso 1 o 2. La Figura 2B muestra una visión general de los procedimientos de recubrimiento.

  1. Descongelar los CnS según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Este procedimiento se aplica a los SCN derivados de H9. Otras líneas celulares requerirán optimización de la densidad celular.
  2. Cuente la concentración celular usando un hemocitómetro y ajuste usando medios NSC para obtener una concentración de 7 x 106 células por ml.
  3. Aspirar medios de cada pozo del chip. Evite aspirar medios desde los canales principales.
  4. Pipeta 5 l de la solución celular en el pozo superior derecho, seguido de 5 l en el pozo inferior derecho (70.000 celdas en total). Asegúrese de que las celdas estén pipetadas hacia las aberturas del canal principal. Utilice un microscopio para comprobar que las células han entrado en el canal. Espere 5 minutos para que las células se adhieran a la parte inferior del chip.
    NOTA: Uno o ambos compartimentos se pueden utilizar para cargar celdas.
  5. Pipet a 150 l de medios NSC en el pozo superior derecho y luego 150 l en el pozo inferior derecho. Repita en el lado izquierdo. Incubar a 5% co2,37 oC dentro de un recipiente humidificado adecuado.
  6. Después de 48 horas, aspirar los medios NSC de los pozos y reemplazar con medios de diferenciación neuronal mediante la adición de 150 l a cada pozo superior y cada pozo inferior bien.
  7. Neuronas de cultivo dentro de una incubadora de CO2del 5%, 37 oC dentro de un recipiente humidificado adecuado.
    NOTA: Los medios deben reemplazarse cada 2-3 días. Debido a los pequeños volúmenes utilizados en el chip, la evaporación incluso dentro de una incubadora humidificada puede afectar sustancialmente la viabilidad celular. Utilice un recipiente secundario adecuado para proporcionar humedad adicional para el cultivo a largo plazo de las células con el chip (ver Tabla de Materiales).

3. Etiquetado fluorescente viral de las neuronas hSC dentro del chip

NOTA: Se pueden utilizar varios virus para etiquetar las neuronas dentro del chip. Las instrucciones a continuación describen el uso de G-deleted Rabies-mCherry o –eGFP virus. Los materiales potencialmente infecciosos deben manipularse de acuerdo con las normas y reglamentos aplicables, y pueden requerir capacitación adicional y aprobación institucional.

  1. Caliente 400 s de medios de diferenciación neuronal frescos por chip a 37 oC.
  2. Retire 50 ml de medios de un pozo del compartimiento de axón en un tubo de centrífuga y luego agregue 100.000 unidades virales del virus de la rabia modificado al tubo.
    NOTA: Deseche adecuadamente las puntas de pipeta gastadas y los tubos de centrífuga que contengan virus.
  3. Retire el medio de diferenciación neuronal restante del compartimiento axonal y colóquelos en un tubo centrífugo. Conservar a 37oC.
    NOTA: Asegúrese de que los canales permanezcan llenos de líquido.
  4. Mezcle los 50 ml de solución de virus con 150 ml de medios calentados. Pipet 100 l a un pozo del compartimiento de axón y 100 l al otro pozo del compartimiento de axón. Incubar durante 2 h dentro de una incubadora de 37oC.
    NOTA: La diferencia de volúmenes entre los compartimentos axonal y somático ayuda a garantizar que el virus permanezca en el compartimiento axonal durante los tiempos de infección/incubación.
  5. Retirar y eliminar los medios que contienen virus.
    ADVERTENCIA: No retire el líquido dentro de los canales microfluídicos cerrados.
  6. Pipetee suavemente 75 ml de medios frescos a un compartimiento de axón bien y deje que el medio fluya a través del canal hacia otro pozo de axón.
  7. Retire los medios del compartimiento del axón y deseche correctamente.
  8. Repita los pasos 3.6 y 3.7.
  9. Llene el compartimiento de axón con el soporte guardado. Pipetee un medio fresco adicional de 50 l, si es necesario, y luego devuelva el chip a la incubadora. Este medio fresco adicional debe contar para la pérdida de medios durante la transferencia de líquido y la evaporación durante el proceso.
    NOTA: El etiquetado fluorescente visible con estos virus de la rabia modificados se produce en 48 h y hasta 8 días después de lo cual la muerte celular de las neuronas infectadas generalmente ocurre debido a la toxicidad del virus. Las imágenes de neuronas se pueden realizar como con otras plataformas de cultivo estándar (por ejemplo, platos de fondo de vidrio), pero se necesita una consideración especial para mantener suficiente humedad para evitar pérdidas evaporativas.

4. Aislamiento fluido, axotomía e inmunomancha dentro del chip

  1. Siga el aislamiento fluídico, la axotomía y la inmunomancha ción con el chip como se describe en Nagendran et al.12.

Resultados

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Después de una semana (7-10 días) en el chip con medios de diferenciación, los NSC se diferencian en neuronas y las proyecciones neuronales entran en el compartimiento axonal (Figura3). Dentro del chip, las neuronas se unen y distribuyen uniformemente dentro del compartimento somático. En comparación, las neuronas en los dispositivos PDMS se agrupan/agregan tan pronto como 5 días después de la adición de medios de diferenciación, lo que conduce a la salud celular comprometida como se puede ver en la Figura 3B (día 13 imagen ampliada). Las neuronas en los chips se ven saludables con axones incluidos. Las neuronas sanas se pueden mantener dentro de las fichas durante 4-5 semanas.

Para visualizar la maduración de las neuronas y el desarrollo de la columna vertebral dendrítica, el virus de la rabia modificado se entregó al compartimento axonal en el día 29 para retrógrado las neuronas de la etiqueta, incluidas las espinas dendríticas, con proteína fluorescente mCherry. Cuatro días después de la infección por el virus de la rabia, las neuronas que extienden los axones hacia el compartimiento axonal expresaron mCherry. Las neuronas en el día de diferenciación 33mostraron la formación de espinas dendríticas (Figura 4). La visualización de las espinas dendríticas demuestra que las neuronas derivadas del NSC diferenciadas dentro de los chips forman sinapsis maduras.

El chip multi-compartimento también es compatible con la inmunocitoquímica para visualizar la localización celular de la proteína. Después de 26 días de mantener las neuronas en medios de diferenciación, las neuronas fueron etiquetadas para el marcador sináptico excitatorio, vGlut1 (Figura 5). Estos resultados muestran que las neuronas etiquetadas viralmente colocalizan con vGlut1 (Figura 5E) y marcador específico de neuronas, -tubulina III (Figura 5F-H).

La capacidad de crear diferentes microambientes aislados a los axons también se demostró utilizando La hidrazida Alexa Fluor 488, un tinte fluorescente de bajo peso molecular (Figura6).

Los estudios de lesiones de Axon se realizan comúnmente dentro de dispositivos compartimentados. Se realizó una prueba de principio para lesionar selectivamente axons de neuronas diferenciadas con el chip COC premontado (Figura7). Los resultados fueron equivalentes a los dispositivos compartimentados de silicona6,13,14.

figure-results-1
Figura 1: El CHIP microfluídico multicompartimento CO-montado premontado. (A) Un dibujo del chip que identifica los pozos superior e inferior. El tamaño del chip es de 75 mm x 25 mm, el tamaño de las diapositivas de microscopio estándar. (B) Una región ampliada que muestra los canales y microgrooves que separan los canales. Se proporcionan detalles adicionales en Nagendran et al.12. (C) Esta fotografía ilustra la creación de microambientes aislados dentro de cada compartimiento utilizando tinte colorante de alimentos. Toda esta cifra ha sido reproducida a partir de 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Recubrimiento de viruta compartimentado de plástico y línea de tiempo de revestimiento de celdas NSC. (A) Los chips multicompartimento de plástico fueron recubiertos con una solución de pre-recubrimiento, y luego poli-L-ornitina y laminina antes del pre-acondicionamiento con medios NSC. (B) los SCN estaban chapados con 7 x 104 células en el compartimento somático del chip. Las células fueron cultivadas en medios NSC durante 24 h y luego los medios fueron reemplazados por medios de diferenciación neuronal. Las neuronas diferenciadas se observaron por 7-10 días después de la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: comparación de crecimiento de hSC-neurona en chips y dispositivos PDMS. (A) Una imagen de contraste de fase de las neuronas hSC cultivadas a los 13 días después de la diferenciación en el chip multicompartimento de plástico. (B) Una región ampliada de neuronas hSC cultivadas dentro del cuadro blanco en (A) y una región equivalente dentro de un dispositivo PDMS (derecha). las neuronas hSC dentro de los chips se fijan bien. Los grupos de neuronas agregados se forman en dispositivos basados en PDMS. Representante de 2 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Las neuronas derivadas de NSC humanomuestran morfología delafótica de la columna vertebral. Neurona mCherry retrógrada etiquetada en el día de diferenciación 33 cultivado dentro del chip. La región magnificada esbozada en rojo, destaca la presencia de espinas dendríticas, que proporcionan evidencia que apoya el desarrollo de sinapsis glutamatérgicas maduras. Las flechas rojas apuntan hacia las espinas dendríticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Las neuronas derivadas de NSC humano cultivadas dentro de chips exhiben sinapsis excitatorias. La inmunomancha se realizó en la diferenciación del día 26. La imagen de la neurona se realizó en el compartimento somático. A) vGlut1 (verde) y (B) Inmunoetiquetado DAPI (azul). (C) neuronas etiquetadas con mCherry (rojo) retrógradas etiquetadas con un virus de la rabia modificado. (D) Un micrográfico fluorescente fusionado de (A-C). (E) Espinas dendríticas y puncta positivo vGlut1 colocalizadas con dendritas mCherry positivas, que se muestran en una región ampliada desde (D). Micrografías de inmunofluorescencia de (F) marcador específico de neurona, á-tubulina III (magenta) y (G) vGlut1 (verde). (H) Superposición de la tubulina III y vGlut1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Las neuronas mCherry transducidas viralmente extienden las proyecciones en un microambiente localizado de axón establecido dentro del chip COC premontado. (A) neurona etiquetada mCherry extender axons a través de los microgrooves del chip y en un compartimiento de axón aislado. El aislamiento del compartimiento de axón se visualiza con la hidrazida Alexa Fluor 488. Las imágenes de las neuronas ocurrieron en los días de diferenciación 26 y 3 días después de la infección con el virus de la rabia modificado. (B) La imagen de fluorescencia en (A) se fusiona con una imagen DIC. Observe la ubicación de las microranuras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-7
Figura 7: Axotomía realizada dentro del chip multicompartimento COC. (A) mCherry etiquetas neuronas en el día de diferenciación 33 fueron imágenes antes de la axotomía. Tabla de aspecto de color 'Fuego'. (B) Inmediatamente después de la axotomía, mostrando que los axons están completamente cortados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Chips multicompartimento de plásticoDispositivos multicompartimento PDMS
aíslan axonsaíslan axons
establecer microambientesestablecer microambientes
axotomizca las neuronasaxotomizca las neuronas
ópticamente transparenteópticamente transparente
compatible con imágenes de alta resolucióncompatible con imágenes de alta resolución
compatible con microscopía de fluorescenciacompatible con microscopía de fluorescencia
completamente montadomontaje al sustrato requerido
axóns sanos >21 díasaxóns sanos >14 días
superficie de cultivo hidrófiloHidrofóbico
gas impermeablegas permeable
microgrooves y canales redondeadosmicrogrooves rectos
no es compatible con la ablación láserSe puede utilizar para la ablación láser cuando las cámaras PDMS se montan en diapositivas especiales compatibles con la ablación láser.
dispositivo no se puede modificar para eliminar la parte superiorsuperior es extraíble para la tinción dentro de microgrooves
no es compatible con aceites de inmersión a base de aceite mineral (los aceites a base de silicona están bien)compatible con aceites de inmersión a base de aceite mineral
impermeables a pequeñas moléculas y disolventes orgánicosabsorción de moléculas pequeñas y disolventes orgánicos
Sin problemas de fugas con el chiprecubrimiento con poli-L-ornitina y laminina hacen que los dispositivos gotean
las neuronas diferenciadas permanecen distribuidas uniformemente (> 4 semanas) en las densidades celulares probadasneuronas diferenciadas comienzan a acumularse después de 3-4 días en cultivo en las densidades celulares probadas

Tabla 1: Comparación de chips COC multicompartimento y dispositivos de silicona para el cultivo de neuronas

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El chip COC multicompartimento premontado es una plataforma compartimentada fácil de usar para diferenciar y mantener los SCN humanos en neuronas durante largo plazo (>4 semanas). En este protocolo, demostramos la diferenciación de los InSC humanos en neuronas glutamatérgicas, neuronas de etiquetas retrógradas, realizamos inmunocitoquímica, visualizamos morfología dendrítica de la columna vertebral y realizan axotomía. Estos chips son compatibles con imágenes de alta resolución y no hay autofluorescencia con el COC12.

Los chips multicompartimento COC son funcionalmente equivalentes a los dispositivos compartimentados basados en silicona y tienen beneficios e inconvenientes como se describió anteriormente12. La Tabla 1 compara chips COC multicompartimento y dispositivos de silicona para el cultivo de neuronas hSC. Las virutas compartimentadas COC proporcionan una mejor superficie hidrófila para la fijación y el mantenimiento de células madre durante un largo período de cultivo. Los dispositivos basados en PDMS deben montarse y conectarse a los cubreobjetos de vidrio. La naturaleza hidrófoba de los dispositivosPDMS provoca la agregación de células madre 5; esto conduce a ambos desafíos en la toma de imágenes a nivel celular y una mayor susceptibilidad al daño físico debido al movimiento de los agregados celulares durante los cambios en los medios. El chip de plástico supera estos desafíos. El COC es impermeable al gas, a diferencia de PDMS, por lo que las bolsas de aire atrapadas o formadas dentro de los canales deben ser retiradas por el usuario. La solución de pre-recubrimiento reduce la posibilidad de que el aire quede atrapado en los canales. Esta solución consiste en etanol y otros agentes. Un protocolo publicado previamente para el cultivo de neuronas murinas dentro de estos chips de plástico proporciona detalles adicionales sobre las células de pipeteo y los medios dentro de los chips12. Los NSC son más frágiles que las neuronas murinas, por lo que deben ser manejados más suavemente. También es fundamental mezclar las células madre a fondo antes de enchaparlas pipetándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo.

El uso de neuronas derivadas de células madre humanas diferenciadas in vitro se está volviendo cada vez más popular en la medicina y la investigación. Estas neuronas son importantes para la investigación y aplicaciones clínicas para muchos trastornos del SNC, incluyendo enfermedades neurodegenerativas y lesiones cerebrales traumáticas. Estas neuronas se asemejan mucho a las neuronas fetales humanas15. En el futuro, las neuronas envejecidas apropiadamente podrían ser generadas a partir de células madre para imitar la función neuronal relacionada con la edad y utilizarse junto con estos dispositivos compartimentados. Estos dispositivos facilitarán la investigación en enfermedades que afectan a la salud y la función del axón como los déficits de axón en las neuronas de los pacientes diagnosticados con trastornos del espectro autista y regeneración axonal después de la lesión16,17.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.P. y T.N. no declaran intereses financieros que compitan. V.P. es un empleado de Xona Microfluidics, LLC. J.H. es miembro de Xona Microfluidics, LLC. A.M.T. es un inventor de la cámara/chip microfluídico (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) y es miembro de Xona Microfluidics, LLC.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores reconocen el apoyo de Xona Microfluidics, LLC, el Instituto Nacional de Salud Mental (R42 MH097377), y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (R41 NS108895, P30 NS045892). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor hidrazida 488ThermoFisher ScientificA10436
Alexa Fluor anticuerpos secundariosThermoFisher Scientific1:1000
anti_beta-tubulina IIIAvesTUJ1:1000
anticuerpo anti-vGATSynaptic Systems131 0031:1000
anticuerpo anti-vGlut1NeuroMab75-066clon N28/9, 1:100
completo medios de células madre neurales:
  REC HU EGF
10 UG BIOSOURCE (TM) 		ThermoFisher Scientific PHG031420 ng/mL 
REC HU FGF BASIC
10 UG BIOSOURCE (TM) 		ThermoFisher Scientific PHG002420 ng/mL 
Suplemento GlutaMAX (100X)ThermoFisher Scientific350500612mM 
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher Scientific 
StemPro Neural SupplementThermoFisher ScientificA10508012%
Sistema de imagen de epifluorescenciaEVOS Sistema de imagen de fluorescenciaAMF4300
objetivo 10x American Durafilm50A0.5 mil de espesor
Fluoromount GThermoFisher Scientific00-4958-02
Gibco DPBS sin Calcio y MagnesioThermoFisher Scientific14190144
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT
COMBO KIT
 
 		GibcoN7800200
Gibco LamininThermoFisher Scientific23017015
Glass pipetasPasteur Sigma-AldrichCLS7095D5X SIGMA5,75 DE LONGITUD
MADRE NEURALES HU DERIVADAS DE H9
1E6 CÉLULAS/VIAL; 1 ML 		Medio de510088
E IncubadoraA1247601ThermoFisher Scientific
, 5 % de CO2 37 ° C
Sistema de imágenes confocales de escaneo láserOlympusFV3000RS30x aceite de silicona objetivo
de la rabia modificadoInstituto Salk de Estudios BiológicosG-deleted Rabia-eGFPAcuerdo de transferencia de material requerido
Sr. Frosty ThermoFisher Scientific5100-0001
Neural differentiation mediaPer 100 mL. 
Antibiótico-Antimicótico (100X)ThermoFisher Scientific 152401121mL (100X)
Ácido ascórbicoSigma AldrichA8960200mM 
BDNFThermoFisher Scientific PHC707440 ng/mL 
Gibco B27 Plus Suplemento (50X)FisherScientificA35828012 ml (50X)
Gibco CultureOne Suplemento (100X) FisherScientificA33202011 ml (100X)
Gibco Neurobasal Plus MedioFisherScientificA3582901
StemPro Accutase Reactivo de disociación celularThermoFisher ScientificA1110501
Taylor Wharton Líquido N2 dewarFisherScientific20HCB11M
triton X-100ThermoFisher Scientific28314
Precapa XC Xona Microfluidics, LLCXC Pre-Coatincluido con XonaChips
XonaChipXona Microfluidics, LLCXC450450 µ barrera de microranura de longitud m
bandeja humidificadoraXona Microfluidics, LLChumidificadora
12660012 película de etileno propileno fluorado CÉLULAS hibernación ThermoFisher Scientific de virus bandeja

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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