Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Se describe un procedimiento paso a paso para la inmovilización sin etiquetas de exosomas y vesículas extracelulares a partir de muestras líquidas y sus imágenes mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes AFM se utilizan para estimar el tamaño de las vesículas en la solución y caracterizar otras propiedades biofísicas.

Resumen

Los exosomas y otras vesículas extracelulares (EV) son complejos moleculares que consisten en una vesícula de membrana lipídica, su decoración superficial por proteínas de membrana y otras moléculas, y diverso contenido luminal heredado de una célula madre, que incluye ARN, proteínas y los ANN. La caracterización de los tamaños hidrodinámicos de los vehículos eléctricos, que depende del tamaño de la vesícula y su capa coronal formada por decoraciones superficiales, se ha convertido en rutina. Para los exosomas, el más pequeño de los vehículos eléctricos, la diferencia relativa entre los tamaños hidrodinámico y vesícula es significativa. La caracterización de los tamaños de las vesículas mediante la imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), una técnica estándar de oro, sigue siendo un desafío debido al costo del instrumento, la experiencia necesaria para realizar la preparación de la muestra, la toma de imágenes y análisis de datos, y un pequeño número de partículas a menudo observadas en las imágenes. Una alternativa ampliamente disponible y accesible es la microscopía de fuerza atómica (AFM), que puede producir datos versátiles sobre geometría tridimensional, tamaño y otras propiedades biofísicas de las vesículas extracelulares. El protocolo desarrollado guía a los usuarios en la utilización de esta herramienta analítica y describe el flujo de trabajo para el análisis de vehículos eléctricos por el AFM, que incluye la preparación de muestras para la toma de imágenes de vehículos eléctricos en forma hidratada o desecada, la inmovilización electrostática de vesículas en un sustrato, adquisición de datos, su análisis e interpretación. Los resultados representativos demuestran que la fijación de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada es predecible, personalizable y permite al usuario obtener resultados de tamaño para un gran número de vesículas. Se encontró que el tamaño de la vesícula basada en los datos de AFM era consistente con las imágenes crio-TEM.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) están presentes en todos los fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche y el líquido amniótico. Los exosomas forman una clase de distrito de vehículos eléctricos diferenciados de otros vehículos eléctricos por biogénesis endosomal, los marcadores de la vía endosomal y el tamaño más pequeño entre todos los vehículos eléctricos. El tamaño de los exosomas a menudo se notifica con una variabilidad sustancial entre los estudios. Se encontró que los resultados del tamaño dependían del método, lo que refleja la diferencia en los principios físicos empleados por diferentes técnicas analíticas para estimar los tamaños de EV

Protocolo

1. Aislamiento de los vehículos eléctricos de un biofluido

1. Aísle los vehículos eléctricos mediante uno de los métodos establecidos, como la ultracentrifugación diferencial⁸, la precipitación o la cromatografía de exclusión de tamaño^9.
2. Confirmar la presencia de biomarcadores superficiales y luminales esperados y la ausencia de biomarcadores que indiquen la contaminación cruzada del preparado. Confirmar la morfología bicapa lipídica de las partículas aisladas mediante microscopía electrónica.
   NOTA: Al aislar los exosomas, la distribución del tamaño hidrodinámico medida por el análisi....

Resultados

La fijación superficial de los vehículos eléctricos es un paso crítico en la secuencia de imágenes. La inmovilización electrostática de la superficie de los exosomas, que se sabe que tiene un potencial zeta negativo, se producirá de forma robusta después de que el sustrato de la mica se modifique para tener una carga superficial positiva. Sin el tratamiento con NiCl₂ para impartir cambios positivos en la superficie, se encontró que la inmovilización de los vehículos eléctricos en el sustrato era ineficaz. La i.......

Discusión

La inmovilización de los vehículos eléctricos de un fluido biológico, el escaneo de superficies y el análisis de imágenes son los pasos esenciales del protocolo desarrollado para la caracterización AFM de los vehículos eléctricos en líquido. El número de vesículas susceptibles a las escalas de imágenes AFM con el área de superficie de la imagen y la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas en el sustrato. Dado un potencial zeta negativo de vehículos eléctricos y exosomas^18,abogamos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Controlador AFM/STM		Nanoscopio multimodo Bruker V	Este controlador AFM admite la obtención de imágenes de muestras biológicas en líquido y aire.
Discos de muestras metálicos AFM/STM (10 mm)	TedPella	16207	Disco de muestras metálico al que se fija un disco de mica mediante una cinta adhesiva de doble cara u otros medios.
Discos de mica AFM/STM (10 mm)	TedPella	50	Mica V1 de la más alta calidad, 0,21 mm (0,0085") de grosor. Intercalados, en paquetes de 10. Se puede montar en discos AFM/STM. Disponible en cuatro diámetros:
Sonda AFM para la obtención de imágenes en el aire	Bruker	TESP-V2	Sondas de silicona grabada de alta calidad para el modo de golpeteo y el modo sin contacto para el escaneo en el aire.
Sonda AFM para la adquisición de imágenes de muestras blandas en voladizos líquidos	de		nitruro de silicio Bruker MLCT Soft con puntas de nitruro de silicio, que son muy adecuadas para el funcionamiento con líquidos. El rango de constantes de fuerza permite a los usuarios obtener imágenes de muestras extremadamente blandas en modo de contacto, así como espectroscopía de alta carga frente a distancia.
Cinta adhesiva de doble cara	Spectrum	360-77705	Se utiliza para fijar el disco de mica en el disco de muestra metálico.
Sistema ExoQuick-TC	Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC es un kit patentado a base de polímeros diseñado para el aislamiento de exosomas a partir de medios de cultivo de tejidos.
Soporte AFM de sonda de vidrio para imágenes en Bruker líquido		MTFML-V2	Este soporte de sonda de vidrio está diseñado para escanear en fluidos con el AFM multimodo. El soporte se puede utilizar en modo de golpeo de fuerza máxima, modo de contacto, modo de golpeteo y modulación de fuerza. La sonda es impulsada acústicamente por un oscilador piezoeléctrico separado para una modulación de mayor amplitud. El soporte se suministra con dos puertos, los accesorios necesarios y el kit de accesorios para agregar y eliminar fluidos.
Instituto Checo de Metrología	de Gwyddion	Versión 2.52	Software de código abierto para la visualización y análisis de campos de datos obtenidos mediante técnicas de microscopía de sonda de barrido.
Papel secante sin pelusa	GE Healthcare Whatman	Papel secante de grado GB003	Utilice este papel secante para eliminar el NiCl2 después de la modificación del sustrato de la mica.
Toallitas para salas limpias sin pelusa	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Utilice estas toallitas de poliéster para la limpieza de superficies.
Cloruro de níquel (II) (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Polvo utilizado para hacer 10 mM de NiCl2 en agua desionizada
Solución salina tamponada con fosfato (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4

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