Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Summary

El modelo de la matriz extracelular (BEM) de hueso para el osteosarcoma (OS) está bien establecida y se muestra aquí. Puede utilizarse como un andamio adecuado para mímico el tumor primario crecimiento en vitro y proporcionando un modelo ideal para el estudio de la heterogeneidad histologic y cytogenic de OS.

Abstract

Osteosarcoma (OS) es el más común y un tumor óseo primario altamente agresivos. Se caracteriza con variaciones anatómicas e histologic junto con dificultades en el diagnóstico o pronósticas. OS compone de las células cancerosas genotípicamente y fenotípicamente heterogéneas. Elementos del microambiente de hueso se han demostrado a cuenta de la heterogeneidad y la enfermedad la progresión del tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) conserva el microestructurales matrices y componentes bioquímicos de la matriz extracelular nativa. Este nicho específico de tejido proporciona un andamiaje favorable y a largo plazo para la proliferación y células OS siembra. Este artículo proporciona un protocolo para la preparación del modelo BEM y su aplicación experimental. OS células pueden crecer y diferenciarse en múltiples fenotipos compatibles con la complejidad histopatológica de los especímenes clínicos OS. El modelo también permite la visualización de diversas morfologías y su asociación con alteraciones genéticas y mecanismos subyacentes. Como homólogo a OS humanos, este modelo de BEM OS puede ser desarrollado y aplicado a la patología y la investigación clínica de OS.

Introduction

Osteosarcoma (OS) ocurre generalmente en áreas, la metáfisis de huesos largos, en pleno crecimiento durante la adolescencia. Más del 80% de los sitios afectados OS tienen preferencia por la metáfisis de la tibia proximal y húmero proximal como distal y proximal de fémur, correspondiente a la ubicación de la placa de crecimiento¹. Sistema operativo consta de varios subtipos de células con propiedades mesenquimales y una considerable diversidad en las características histológicas y grado. Evidencias apoyan las células madre mesenquimales (MSCs), compromiso de precursores de osteoblastos y pericitos como las células de origen^2,3,4,5. Estas células pueden acumularse alteraciones genéticas o epigenéticas y dar lugar a OS bajo la influencia de ciertas señales microambiental de hueso. Mecanismos intrínsecos y extrínsecos como resultado la inestabilidad genómica y heterogeneidad del sistema operativo, con múltiples fenotipos morfológicos y clínicos^6,7. Terapias individualizadas o screening de nuevas drogas, nuevos modelos tiene que generarse a contra heterogeneidad u otros trastornos clínicos.

OS es un tumor sólido maligno intra óseo. La complejidad y la actividad de alrededor de elementos del microambiente confieren diferencias fenotípicas y funcionales en las células de sistema operativo en diferentes lugares de un tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) proporciona un andamiaje estructural y bioquímico para la deposición mineral y remodelado óseo. La porción orgánica de matriz extracelular (ECM) consiste en principalmente de tipo I colágeno secretada por las células de linaje osteoblástico, mientras que su porción mineralizada está compuesta de fosfato de calcio en forma de hidroxiapatita⁸. El papel dinámico de las redes de ECM es regular la adhesión celular, la diferenciación, la diafonía y tejido función mantenimiento⁹.

Desmineralizada hidrogeles BEM y ECM se han utilizado con éxito en cultivo de células y pueden mejorar la célula proliferación^10,11. ECM como hueso sintetizado puede regular el tamaño, las decisiones del destino y progresión de linaje de MSCs^12,13,14. Por otra parte, resultados prueba de su importancia clínica para proporcionar actividad osteogénica por estimulantes procesos celulares durante hueso formación y regeneración de^15,16,17.

En este artículo, nuestro grupo establece una alternativa favorable para el cultivo a largo plazo tridimensional y modelo modificado. OS las células inyectadas en el tejido derivado de BEM presentan un fenotipo heterogéneo mesenquimal fácilmente en comparación con el plástico bidimensionales culturas. BEM deriva de mostrar tejido homólogo específica su ventaja dramática como siendo un nicho nativo para el sistema operativo en vitro de las células y tiene un gran potencial en investigación clínica y teórica de OS. Esta plataforma BEM caracterizada es simple pero eficaz para la investigación en vitro y podrá ampliarse en modelado a cánceres múltiples.

Protocol

Uso y cuidado de los animales se llevan a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación de NIH NO.80-23, revisada en 1996) después de la aprobación de la Animal ética Comité de Sun Yat-sen la Universidad.

1. preparación de hueso

1. Obtener 4 a ratones BALB/c de 6 semanas de edad (sin el requisito del sexo). Eutanasia a un ratón asépticamente por dislocación cervical y corte fresco del peroné, la tibia y el fémur de una trasera con tijeras quirúrgicas estériles. Retire el tejido epitelial y retire tanto del tejido suave como sea posible usando tijeras y pinzas.
2. Lavar los huesos de la pierna con solución salina estéril 10 mM tamponada fosfato (PBS) dos veces para extraer sangre en un plato de 6 cm. Sumergir los huesos en etanol al 75% durante 3 minutos, luego enjuague dos veces con PBS. Los huesos limpios pueden almacenarse en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con PBS estéril a-80 ° C durante meses hasta que la necesite.
   Nota: PBS utilizados en los siguientes pasos tiene 10 mM PO₄³⁻.

2. hueso desmineralización y descelularización

1. Descongelar los huesos congelados a temperatura ambiente y luego congelar otra vez a-80 ° C por 1 h. tema los huesos a más de 2-3 ciclos de congelación y descongelación para desglose de lisis y el tejido celular.
2. Incubar los huesos en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con 0.5 HCl N durante la noche a temperatura ambiente en un agitador oscilante plataforma o orbital con suave balanceo/agitación para asegurar una cobertura completa e incluso de huesos.
   Nota: Asegúrese de que los huesos se sumergen completamente durante el movimiento en el ácido y no instalarse durante el proceso. El volumen de disolución de HCl debe ser diez veces más que el de los huesos.
3. Después de la descalcificación, decantar la solución de HCl completamente y enjuagar bajo el chorro de agua durante 1 hora. Luego, lave los huesos dos veces durante 15 min por lavado con agua destilada en un agitador oscilante plataforma o orbital.
   Nota: Asegúrese de que eliminar completamente la solución o el agua entre los lavados y después del último lavado con agua destilada.
4. Extraer los lípidos en los huesos desmineralizados con una mezcla 1:1 de metanol y cloroformo en un tubo de centrífuga de 50 mL envuelto con papel de aluminio por 1 h a temperatura ambiente¹⁰.
5. Entonces, transferencia de los huesos en otro tubo de metanol envuelto con papel de aluminio durante 30 minutos sacar el metanol completamente y enjuagar con agua destilada agua dos veces durante 15 min con suave agitación. Decantar el agua de lavado final y continúe con los pasos siguientes bajo condiciones de esterilidad.
   Nota: Durante la etapa de extracción, debe evitarse la luz para evitar la descomposición de cloroformo. La mezcla puede guardarse en un recipiente resistente a la luz o un tubo de centrífuga envuelto con papel de aluminio. Realizar todo el tratamiento y lavar pasos modesto rotación o movimiento de mecedora.
6. Lave los huesos en un plato de 6 cm con PBS estéril por 3 min y luego transferir los huesos en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir 40 mL estéril 0.05% tripsina-EDTA (TE) en el tubo e incubar huesos de 23 h en un incubador de CO₂ a 37 º C¹⁸.
7. Deseche la solución TE y enjuague dos veces con PBS estéril suplementada con 90 de μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90. Después de decantar la final de lavado PBS completamente, llenar con 40 mL PBS estéril. Lavado durante 24 h a temperatura ambiente con el suave balanceo o agitar para remojo antibiótico.
   Nota: Todos lo PBS estéril en este y los siguientes pasos contiene 90 μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90. Lavado durante la noche en rotación o movimiento de balanceo se realizan por inmersión completa prolongado con antibióticos para lograr una esterilización efectiva de espacios de poro.
8. Retirar el PBS y transferir los huesos en un tubo de centrífuga de 50 mL fresco llenado de PBS estéril. Desmineralizado el preparado y huesos decellularized se llaman matriz extracelular del hueso (BEM) y pueden almacenarse a 4 ° C por 2 meses hasta que la necesite.

3. siembra y cultivo de células

1. Sacar el BEM del refrigerador de 4 ° C y sumerja en etanol al 75% durante 30 s, luego enjuague con PBS dos veces. La transferencia del BEM en una placa de cultivo celular 6-bien limpio. Añadir 2 mL completo medio de cultivo (Dulbecco modificado Eagle medio/F12 (DF12) que contiene 5% de suero fetal bovino, 90 de μg/mL ampicilina y kanamicina μg/mL 90). Incubar el BEM durante la noche en un incubador de CO₂ a 37 ° C.
2. Obtener líneas celulares de humano OS (MNNG/HOS y MG-63). Suspender aproximadamente de 1.0 x 10⁵ OS células con 100 μL PBS que contiene rojo de fenol como indicador.
   Nota: Para mejor seguimiento y observar células de múltiples capas en el modelo tridimensional de BEM, MNNG/HOS y MG-63 infectan con vectores lentivirales expresando mCherry fluorescente y proteína fluorescente verde (GFP).
3. Después de que el BEM se sumerge completamente en el medio, inyectar células OS BEM de epífisis proximal o distal cuando la aguja llega a la cavidad medular de BEM. Incubar el modelo BEM OS para un mínimo de 2 h en un vapor 5% CO₂ ambiente a 37 ° C para las células inyectadas se adhieren firmemente a BEM.
   Nota: Caliente previamente todos los medios utilizados para el cultivo celular. La incubadora usada para el cultivo celular tiene un humidificado 5% CO₂ ambiente a 37 ° C.
4. Añadir 1 mL medio de cultivo completo en la placa para cubrir totalmente la superficie de la cultura BEM durante la noche en un incubador de CO₂ a 37 ° C.
5. Modelo de transferencia el BEM OS suavemente en un nuevo pozo de placa de 6 pozos con una pinza estéril y realimentación 1 mL medio de cultivo fresco. El modelo de la cultura durante 14 días en una incubadora de CO₂ a 37 ° C y refrescar el medio de cultivo según la situación de la proliferación de las células del sistema operativo.
6. Mantener seguimiento medio estado de color y de la célula bajo el microscopio de fluorescencia invertido durante el proceso de la cultura. Cuando las células OS amplían a placa, suavemente transferir el modelo BEM OS a otro nuevo con pinzas estériles.
   Nota: El medio de cultivo es rojo a pH 7.4, que es el valor de pH óptimo para el cultivo celular mamífero más. Si el medio se torna amarillo anaranjado o incluso, actualizar inmediatamente el medio para mantener un ambiente sano para las células del sistema operativo.
7. Transferir el modelo de BEM OS en un nuevo pozo con pinzas y enjuague suavemente con PBS para eliminar el medio de cultivo. A continuación, transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL y fijar con formol al 10% tamponado para identificación histológica.

Results

Después de la desmineralización y descelularización, BEM parece ser translúcido con mayor resistencia y tenacidad en comparación con el hueso nativo del ratón. Un pequeño residuo de músculo y el espacio de la cavidad medular pueden observarse claramente (figura 1A, B). Para determinar la efectiva descelularización de BEM, BEM es embebido en parafina después de la fijación y luego cortado en secciones de 3 – 5 μm para coloración hematoxilina-eosina (H & E). La eliminación...

Discussion

En general, OS pueden clasificarse como osteoblástico, condroblástico y fibroblastic subtipos dependiendo de su componente histológico dominante. Su pronóstico es dependiente no sólo de parámetros histologic sino también en su sitio anatómico. Puede ocurrir dentro de los huesos (en los intramedulares o compartimiento intracortical), en las superficies de los huesos y en sitios extraosseous¹⁹. La aparición y la heterogeneidad del sistema operativo pueden ser aclados como una conjugación de eventos o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de centrífuga de 15 mL	Greiner	188271
tubo de centrífuga de 50 mL	Greiner	227270
placa de cultivo celular de 6 cm	Greiner	628160
placa de 6 pocillos	Greiner	657160
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J ratón	Sun Yat-sen Laboratorio Universitario Incubadora
de CO2	SHEL LAB	SCO5A
Fosfato de sodio dibásico	Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Suero fetal bovino	Hyclone	SH30084.03
Hemocitómetro	BLAU 717805
Kanamicina	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63	Academia China de Ciencias, Banco		Línea celular de osteosarcoma humano
MNNG/HOS	Academia China de Ciencias, Banco		Línea celular de osteosarcoma humano
Rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P4633	Se utiliza una solución de rojo fenol como indicador de pH: su color exhibe una transición gradual de amarillo a rojo en el rango de pH de 6,6 a 8,0.
Cloruro de potasio	Sangon Biotech	A100395
Fosfato de potasio monobásico	Sangon Biotech	A501211
Cloruro de sodio	Sangon Biotech	A501218