Artículo de método

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 de abril de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gotitas del lípido (LDs) son bioactivos organelos encontrados el citosol de la mayoría eukaryotic y algunas células procariotas. LDs están compuestos de lípidos neutros encajonados por una monocapa de fosfolípidos y proteínas. Lípidos de LD hepáticos, tales como ceramidas y proteínas están implicados en varias enfermedades que causan esteatosis hepática. Aunque los métodos anteriores se han establecido para el aislamiento de LD, requieren una tiempo preparación de reactivos y no están diseñados para el aislamiento de varios compartimentos subcelulares. Se intentó establecer un nuevo protocolo para permitir el aislamiento de LDs, retículo endoplásmico (ER) y lisosomas de hígado de ratón.

Además, todos los reactivos utilizados en el protocolo que presentamos están disponibles en el mercado y requieren de una preparación reactivo mínimo sin sacrificar la pureza del LD. Aquí presentamos datos que comparan este nuevo protocolo un protocolo gradiente de sacarosa estándar, demostrando producción, morfología y pureza comparable. Además, podemos aislar ER y lisosomas utilizando la misma muestra, proporcionando visión detallada de la formación y el flujo intracelular de lípidos y sus proteínas asociadas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs son bioactivos organelos encontrados el citosol de las células eucariotas más y algunas células procariotas1,2,3. El núcleo de la LD está compuesto por lípidos neutros como los triglicéridos (TG) y ésteres de colesterol. También contienen ceramidas, lípidos bioactivos en de4,de vías de señalización celular5. LDs están rodeados por una monocapa de fosfolípidos y recubiertas de proteínas, incluyendo la perilipin proteínas perilipin 2 (PLIN2) y 3 (PLIN3)1,5,6. También están presentes las enzimas lipogénicos, lipasas y proteínas de la membrana la trata de personas que han sido vinculadas a varias enfermedades steatotic hepáticas, incluyendo enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad hepática alcohólica y la hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs se cree que la forma de la membrana externa de la ER y contienen TG recién sintetizada de ácidos grasos libres derivados de ER11. Sin embargo, sigue siendo desconocido si los lípidos combinados bud, permanecer conectados, o son suprimidos de la ER6,11, haciendo el aislamiento de LDs de ER técnicamente difícil. Ácidos grasos libres pueden ser liberados del Sud por la acción de las lipasas superficie para proporcionar para la producción de energía o la síntesis de la membrana. Además, LDs pueden ser degradados a través de lipophagy como un mecanismo regulador y para producir ácidos grasos libres12.

Además del ER y lisosomas, hay otros organelos, como mitocondrias, peroxisomas, endosomas y la membrana plasmática, que se encuentran en estrecha asociación de LDs11. Esta poligamia apretada dificulta realizar una extracción pura de LD. Sin embargo, innata de baja densidad lípidos neutros puede ser aprovechada mediante centrifugación5.

Tradicionalmente, LDs han aislado con una sacarosa densidad gradiente1,5,13. Sin embargo, estos métodos no han sido diseñados para aislar otros organelos. Además, necesitan el tiempo preparación de los reactivos. Este protocolo adapta un aislamiento comercial de ER kit (véase la Tabla de materiales) para permitir el aislamiento de LD. Usamos el tampón de extracción proporcionado por el kit, agregar un paso de aislamiento de LD. Además, el protocolo también puede utilizarse para ER y aislamiento lisosomal utilizando las mismas muestras, lo que permite una imagen más completa del ciclo de vida de LDs. Para validar este nuevo método, ensayo de rendimiento de LD, morfología, tamaño y pureza. Se comparan los resultados presentados aquí a los obtenidos con un protocolo ampliamente utilizado utilizando un gradiente de sacarosa para el aislamiento de LD.

Utilizamos un 10 a 12-semanas de edad, 20 g hembra C57BL/6 ratón ayunó durante 16 h (eliminación de alimentos en 17:00 para un tiempo de aislamiento de LD de 9:00) con acceso libre al agua. El rendimiento típico de TG es 0.6 mg/g hígado y para la proteína del LD, es hígado de 0,25 mg/g. Esto proporciona suficiente material para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. El protocolo a continuación de los datos de los reactivos usados y un protocolo adecuado para un hígado solo 1 g. El protocolo de aislamiento gradiente de sacarosa es adaptado de Sato14 y15de Wu.

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Protocolo

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Todos los experimentos se realizaron en un banco de laboratorio con equipo de protección personal apropiado para el nivel de bioseguridad 1, incluyendo una bata, guantes y gafas de seguridad. Los experimentos fueron realizados según los protocolos aprobados por la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pennsylvania. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el malestar del animal y los animales fueron tratados con atención humana.

1. aislamiento LD utilizando el kit de aislamiento ER

  1. Preparación
    Nota: Las cantidades mencionadas son convenientes para un hígado de ratón solo 1 g.
    1. Preparar 10 mL de tampón de extracción isotónica x 1 (tampón de la IE, del kit del aislamiento del ER) diluyendo 2 mL de tampón de IE x 5 con 8 mL de agua ultrapura. Enfriar el búfer al colocarlo sobre hielo.
    2. Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Enfriar colocando en el hielo.
    3. Para preparar 10 mL de 5% polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluyendo 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.
    4. Enfriar todos los tubos, colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.
    5. Enfriar los centrifugadoras a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad para 15 mL tubos, una centrifugadora de alta velocidad para tubos de 50 mL y una ultracentrífuga.
    6. Esterilice en autoclave los tijeras de disección y pinzas.
  2. Preparación de tejido
    1. Eutanasia el ratón colocando en una cámara llenada de 100% CO2 durante 10 minutos eutanasia confirmar mediante la realización de la dislocación cervical.
    2. Utilizando pinzas estériles y tijeras de disección, cortadas las capas de piel y músculo del abdomen en el eje posterior, anterior al exponer el hígado.
    3. Cortar los ligamentos que conectan el hígado en el diafragma y el intestino. Utilice pinzas para sacar el intestino a hígado, hacia la parte posterior, para exponer los ligamentos.
    4. Corte entre el hígado y la parrilla costal dorsal, pasando de anterior a posterior, hasta que el hígado se libera.
    5. Transferir el hígado a un frío 5 cm plato de Petri con 10 mL de PBS 1 x fría.
    6. Lave el hígado 2 x en una plataforma oscilante en 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm. Retirar 1 x PBS después del último lavado.
    7. Utilizar una cuchilla quirúrgica estéril de tamaño 10 (vea la Tabla de materiales) para cortar el hígado en trozos de 3-5 mm en la placa de Petri (figura 1A) de 5 cm.
    8. Lave el hígado en cubos de 2 x con 10 mL de PBS 1 x fría durante 5 minutos a 4 ° C en la placa de Petri de 5 cm.
      Nota: Para el aislamiento del lisosoma, transfiera 0,5 g de hígado a un homogeneizador limpio 45 mL y seguir las indicaciones suministradas por la extracción de lisosoma kit (véase la Tabla de materiales).
    9. 1 x PBS se decanta y transferir los trozos de hígado picados a la fría 45 mL homogeneizadores Dounce. Asegúrese de que todas las piezas van a la parte inferior de la homogeneizadora.
    10. Agregar 7 mL de tampón de IE 1 x frío (desde el kit de aislamiento ER) y homogeneizar el hielo, moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora durante cada carrera.
    11. Transferir el homogeneizado (figura 1B) a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.
    12. Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de frío 1 x buffer de IE (desde el kit de aislamiento ER) y añadir al resto el homogeneizado.
  3. Aislamiento de LD
    1. Quitar los núcleos centrifugar el homogeneizado en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C (figura 1).
    2. Transferir el sobrenadante postnuclear (PNS) a un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo, frío. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior del tubo de 15 mL se resuspendió antes de transferir el PNS.
    3. Tomar alícuota de PNS para análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.
    4. Para Retire la mitocondrias, Centrifugue la muestra PNS, no la parte alícuota, en una centrífuga refrigerada de alta velocidad a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
      1. Opcional: para aislamientos de LD (EPC) crudo (con la contaminación por citosol y membrana celular), recoger la capa de lípidos superior con una pipeta de vidrio y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Continuar a la sección 1.4.
    5. Transferir el sobrenadante postmitochondrial (PMS) a un tubo de ultracentrífuga. Para evitar la pérdida de LD, asegúrese de que cualquier lípido se reunieron en la parte superior se resuspendió antes de transferir el PMS.
    6. Tomar alícuota de PMS para el análisis de pureza 100 μl y colocar en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL. Situado a un lado en el hielo.
    7. Llene un tubo de ultracentrífuga hasta el borde con frío 1 x buffer de IE para evitar que el tubo que se derrumban durante la ultracentrifugación.
    8. El balance de las muestras y centrifugar en una ultracentrífuga a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (figura 1).
    9. Para quitar la capa de LD, incline el tubo a un ángulo de 45° y utilice una pipeta de vidrio para aspirar. Transfiera el sedimento en un tubo de microcentrífuga de frío 1,7 mL.
      Nota: La pastilla contiene ER aislado. Utilice esta fracción aguas abajo para el aislamiento de ER.
    10. Recoger 100 μl del sobrenadante post-ER (por) debajo de la capa de lípidos para el análisis de pureza.
  4. Lavado de LD
    1. Añadir 1 x PBS a la fracción de LD recopilada en un tubo de microcentrífuga 1.7, para un volumen total de 1,3 mL.
    2. Vórtice de la muestra.
    3. Centrifugar en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C para que sedimenten los residuos celulares. Caliente el tubo suavemente con las manos para ayudar a suspender de nuevo la capa de LD. Transferir el sobrenadante, incluyendo la capa de lípidos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    4. Repita los pasos 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, hasta que la pastilla ya no es visible.
    5. Añadir 1 x PBS a la LD pellet-libre sobrenadante hasta un volumen final de 1.5 mL. La fracción lipídica de la colada por centrifugación en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C.
    6. Retirar 1 mL de 1 x PBS (por debajo de la capa de lípidos) con una pipeta de vidrio sin alterar la capa de lípidos.
    7. Repita los pasos 1.4.5 y 1.4.6 4 x x-5, hasta que el PBS 1 x es visualmente transparente con ninguna turbidez.
    8. Quitar todos los PBS 1 x por debajo de la capa de lípidos, con una pipeta de vidrio (Figura 1E).
    9. Utilizar el resultado, una fracción pura de LD, para posteriores análisis.
  5. Cuantificación de la proteína de LD por análisis ácido bicinchoninic
    Nota: No use un ensayo ácido bicinchoninic (BCA) si morfología LD debe evaluarse.
    1. Resuspender el LD en 500 μL de PGPE 5%.
    2. Hervir las muestras por 5 min a 95 ° C, vortex e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos enfriar.
    3. Repita el paso 1.5.2 un adicional 2 x.
    4. Someter a ultrasonidos las muestras durante 5 minutos con una 30 s/ciclo, a intensidad media.
    5. Normalizar las muestras mediante la medición de la concentración de proteína en todas las muestras de análisis de pureza y en la fracción de LD por ensayo BCA.

2. aislamiento LD mediante gradiente de densidad de sacarosa

  1. Preparación
    1. Hacer 200 mL de buffer TE (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Enfriar colocando en el hielo.
    2. Hacer 100 mL de solución de sacarosa de 60% (p/v) en tampón TE disolviendo 60 g de sacarosa en solución tampón TE, llevando el volumen final a 100 mL. Enfriar colocando en el hielo.
    3. Hacer 6 mL de solución de sacarosa al 40% (w/v) añadiendo 4 mL de sacarosa al 60% a 2 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    4. Hacer 6 mL de solución al 25% (p/v) de sacarosa añadiendo 2.5 mL de sacarosa al 60% a 3,5 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    5. Hacer 4 mL de solución 10% (p/v) de sacarosa añadiendo 0,7 mL de sacarosa al 60% a 3,3 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    6. Tomar 10 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa mediante la adición de una tableta de inhibidores de la proteasa y fosfatasa a 10 mL de tampón TE.
    7. Preparar el tampón de homogeneizado de tejido añadiendo 4 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de solución stock de 60% de sacarosa. Enfriar colocando en el hielo.
    8. Preparar el tampón de recubrimiento añadiendo 2 mL de solución de inhibidor de la proteasa y fosfatasa a 50 mL de tampón TE. Enfriar colocando en el hielo.
    9. Diluir 10 mL de PBS de x 10 en 90 mL de agua ultrapura para preparar 100 mL de 1 x PBS. Enfriar colocando en el hielo.
    10. Preparar 10 mL de 5% PGPE por dilución a 500 μl de PGPE en 9,5 mL de agua ultrapura. Utilice una jeringa de 1 mL para medir PGPE como es viscoso. Enfriar colocando en el hielo.
    11. Enfriar los tubos de centrífuga siguientes colocándolos en hielo: tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL y 13 mL tubos de ultracentrífuga.
    12. Enfriar las centrifugadoras requiere a 4 ° C: una microcentrífuga, una centrífuga de alta capacidad (para tubos de 15 mL), una centrifugadora de alta velocidad (para tubos de 50 mL) y una ultracentrífuga.
  2. Preparación de tejido
    1. Utilizar pasos 1.2.1–1.2.9 para preparar el tejido para homogeneización.
    2. Agregar 7 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y homogeneizar el hielo moviendo la mano arriba y abajo de 20 x. Durante los cinco primeros trazos, asegúrese de que la mano va a la parte inferior de la homogeneizadora.
    3. Transferir el homogenizado a un tubo de centrífuga de 15 mL frío.
    4. Enjuagar el homogeneizador con 1 mL de tampón de homogeneizado de tejido frío y transferir al tubo de centrífuga 15 mL previamente usados.
    5. Llevar el volumen del homogeneizado hasta 10 mL con buffer de homogeneizado de tejido.
    6. Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta capacidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
    7. Transferencia 8 mL del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 mL.
    8. Transfiera 100 μl del sobrenadante restante como muestra PNS para análisis de pureza.
  3. Gradiente de sacarosa
    1. El tubo de centrífuga de 50 mL que contenga 8 mL de PNS en un ángulo de 45° de inclinación. Añadir cuidadosamente 6 mL de solución de sacarosa al 40%, asegurando que las dos fases alojarte separadas.
    2. De manera similar, lentamente agregar 6 mL de solución de sacarosa al 25%; a continuación, añadir 4 mL de solución de sacarosa al 10%; por último, añada 8 mL de tampón de recubrimiento.
    3. Centrifugue la muestra en una centrífuga de alta velocidad a 30.000 x g a 4 ° C durante 30 minutos.
    4. Transferir la capa superior conteniendo el Sud a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
    5. Para el lavado de LD, siga los pasos en la sección 1.4.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos realizado el aislamiento de LD con el kit de ER en aproximadamente 30 ratones y compararon los resultados con aquellos que siguen el protocolo de aislamiento de sacarosa en aproximadamente 40 ratones. Los resultados reportados son típicos para ambos protocolos. Ratones se mantuvieron en ayuno durante la noche con acceso libre al agua, para aumentar el rendimiento de LD. Aislamiento de LD utilizando un gradiente de sacarosa se ejecute en paralelo con el kit de ER protocolo de aislami...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biología de LD hepático es cada vez más reconocida como un regulador crítico de la fisiología hepatocelular en salud y enfermedad. Como organelos de buena fe, LDs son dinámicos, interactuar con otras estructuras celulares y contienen dentro de los componentes bio-activos involucrados en la homeostasis de lípidos y glucosa. El gradiente de la sucrosa se utiliza habitualmente para el aislamiento de LD y permite a los investigadores a estudiar la estructura de LD, pero requiere hacer numerosas reservas. Hemos demostrado que...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Dr. Carr recibe apoyo a la investigación de productos farmacéuticos interceptar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la familia de Abramson Cancer Research Institute. Este trabajo es apoyado por las subvenciones siguientes: NIAAA/NIH R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, la Fundación Robert Wood Johnson, Harold Amos Facultad desarrollo Premio médicos, 7158, IDOM RDC piloto Premio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Este trabajo fue financiado en parte por el NIH P30-DK050306 y sus instalaciones de la base (Patología Molecular y Imaging Core, Biología Molecular del Gene expresión núcleo y base de la cultura de célula) y su piloto programa de subvenciones. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mezclador de vórtice BioExpressGeneMateS-3200-1Centrífuga mezcladora de vórtice
54242 REppendorf54242 RContracentrífuga refrigerada
Rotor: Centrífuga FA-45-24-11
Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Centrífuga refrigerada de alta velocidad
Rotor: Centrífuga F21S-8x50y
Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Centrífuga refrigerada de alta capacidad
Rotor: 75006445 Cubeta: 75006441
Cóctel de inhibidores de proteasa COmpleteSigma Aldrich04 693 116 001Tabletas de inhibidores de proteasa
Diagenode Bioruptur UCD-200sonicaciónDiagenodeUCD-200
Molinillo de pañuelos Dounce (45 mL)Wheaton357546Use Mortero suelto
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x)Corning21-031-CM
Kit de aislamiento de retículo endoplásmicoSigma AldrichER0100Para kit de ER Extracción:
Contiene:
Tampón de extracción isotónica 5X 100 mL
Tampón de extracción hipotónica 10 mL
Cloruro de calcio, solución de 2,5 M 5 mL
Medio de gradiente de densidad OptiPrep 100 mL
Aguja de punta roma 1 ea.
Fuente de luz externa para excitación fluorescenteLeicaLeica EL6000
Ácido clorhídricoSigma AldrichH1758Ácido clorhídrico
ImageJSoftware de análisis
de imágenes Microscopio de contraste modulante invertidoLeicaLeica DM IRB
Kit de enriquecimiento de lisosoma para tejidos y células cultivadasThermo Fisher Scientific89839aislamiento de lisosoma
QimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrífugaBeckman-CoulterXL-100KUltracentrífuga
Rotor: SW41Ti
Pipetas PasteurFisher Scientific22-042817
Placa de Petri 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Tabletas inhibidoras de fosfatasa
Cuchilla quirúrgica estéril #10PioneerS2646
SacarosaFisher ScientificS5-500Cristalino/Certificado ACS
Triglicéridos Kit LiquicolorStanbio 2200-225Kit de triglicéridos colorimétricos
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Para tampón TE
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polietilenglicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-éter fenil, Reactivo de lisis de proteínas
EDTA ultrapuro (0,5 M, pH 8,0)Thermo Fisher Scientific15575-038Para tampón TE
Sistema de para cámara microscópica de

Referencias

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