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Artículo de método

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

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DOI:

10.3791/59293

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3 de mayo de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

En este artículo

Resumen

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Resumen

Los organoides derivados del tejido digerido son construcciones tridimensionales (3D) multicelulares que mejor recapitulan las condiciones in vivo que las monocapas celulares. Aunque no pueden modelar completamente la complejidad in vivo, conservan alguna funcionalidad del órgano original. En los modelos de cáncer, los organoides se utilizan comúnmente para estudiar la invasión de células tumorales. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias de ratones irradiados y normales para evaluar la respuesta a la radiación en los tejidos normales. Estos organoides se pueden aplicar a futuros estudios de cáncer in vitro para evaluar las interacciones de células tumorales con organoides irradiados. Las glándulas mamarias fueron reeliminadas, irradiadas a 20 GY y digerida en una solución de colagenasa VIII. Los organoides epiteliales fueron separados a través de la diferenciación centrífuga, y los organoides 3D fueron desarrollados en microplacas de baja adherencia de 96-well. Los organoides expresaron el característico marcador epitelial citoqueratina 14. La interacción de los macrófagos con los organoides se observó en experimentos de co-cultivo. Este modelo puede ser útil para estudiar interacciones tumor-stromal, infiltración de células inmunitarias y polarización de macrófagos dentro de un microambiente irradiado.

Introducción

Aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) eligen la terapia de conservación de mamas (BCT) como forma de tratamiento1. En esta modalidad de tratamiento, se extrae el tumor que contiene parte del tejido mamario y el tejido normal circundante se expone a la radiación ionizante para eliminar las células tumorales residuales. El tratamiento reduce la recurrencia en gran parte de la población de cáncer de mama; sin embargo, aproximadamente el 13,5% de los pacientes tratados con TNBC experimentan recurrencias locoregionales2. Por lo tanto, estudiar cómo la radiación puede reclutar células tumorales circulantes (CTCS) dará lugar a información importante sobre la recurrencia local3,4.

El trabajo anterior ha demostrado que la radiación del tejido normal aumenta el reclutamiento de varios tipos de células5. En los modelos preclínicos de TNBC, la irradiación del tejido normal aumentó el macrófago y posteriormente el reclutamiento de células tumorales a los tejidos normales5. El estado inmune influyó en el reclutamiento de células tumorales en sitios irradiados, con migración de células tumorales observadas en sujetos inmunodeprimido. La recapitulación de estas interacciones utilizando organoides derivados de glándulas mamarias permitirá la observación de la migración celular y las interacciones celular-stromal en tiempo real con la microscopía y las imágenes de células vivas para determinar el papel del daño por radiación en la alteración comportamiento de las células tumorales.

Los organoides mamarios de ratones han ayudado a aclarar los pasos clave en el desarrollo de la glándula mamaria. Un organoide mamario es una construcción tridimensional multicelular de epitelio mamario aislado que es más grande que 50 μm6,7,8,9,10. Utilizando los organoides epiteliales primarios, Simian y otros evaluaron los factores necesarios para la ramificación en la glándula mamaria7. Shamir y otros descubrieron que la diseminación puede ocurrir sin un epitelio a la transición mesenquimal, proporcionando una visión de la cascada metastásica8. Los métodos para generar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias están bien establecidos6,11,12,13. Sin embargo, según nuestro conocimiento, no se han notificado métodos para cultivar organoides irradiados a partir de glándulas mamarias. Un protocolo para cultivar y caracterizar los organoides irradiados sería un paso crítico en la recapitulación del reclutamiento inmunológico inducido por radiación y de células tumorales.

En este documento, se informa de un método para cultivar y caracterizar los organoides epiteliales mamarios irradiados en microplacas de baja adherencia recubiertas con un polímero hidrófilo que apoya la formación de esferoides. Estos organoides fueron cocultivados con macrófagos para examinar la cinética de infiltración de células inmunitarias. Este trabajo se puede ampliar para incluir organoides de coculturación con células adiposas para recapitular características mamarias, células de cáncer de mama para visualizar el reclutamiento de células tumorales, y las células T CD8 + para estudiar las interacciones de células inmunes del tumor. Se pueden utilizar protocolos previamente establecidos para evaluar los organoides irradiados. Los modelos anteriores que coculturan los organoides mamarios y las células inmunitarias han arrojar luz sobre los mecanismos de metástasis y diseminación. DeNardo y otros descubrieron que la regulación de linfocitos T CD4 + de los macrófagos asociados al tumor mejoró un fenotipo metastásico de adenocarcinomas mamarios14. También se han utilizado modelos de cocultivo para dilucidar los mecanismos de desarrollo biológico. Plaks et al. aclaró el papel de las células T CD4 + como reguladores de la organogénesis mamaria15. Sin embargo, nuestro grupo es el primero en establecer un procedimiento para visualizar cómo la irradiación del tejido normal influye en el comportamiento de las células inmunes. Debido a que se ha demostrado que la irradiación del tejido normal mejora el reclutamiento de células tumorales5, este protocolo se puede desarrollar aún más para analizar cómo el comportamiento de las células tumorales se altera por la irradiación del tejido y las células normales, lo que conduce a una mayor comprensión de recurrencia del cáncer.

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Protocolo

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y protocolos aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Vanderbilt.

1. preparación de ratones y adquisición celular (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Sacrificar ratones nu/nu atímicos (8-10 semanas de edad) usando asfixia por Co2 seguida de luxación cervical. Limpie la piel con etanol al 70%.
  2. Resect las glándulas mamarias abdominales e inguinales de los ratones utilizando tijeras y fórceps preesterilizados. Extirpar los ganglios linfáticos antes de la resección. Enjuagar en solución salina amortiguada de 1x fosfato estéril (PBS) (figura 1A).
  3. Colóquelo en tubos de 15 mL con 10 mL de la mezcla de medios y nutrientes modificados Eagle de Dulbecco F12 (DMEM/F12) para el transporte. Las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° c o procesarse inmediatamente. Sigue con hielo.
  4. Irradiar muestras a 20 GY utilizando una fuente de cesio (figura 1B).
  5. 45 min después de la irradiación, colocar las glándulas mamarias en una placa celular estéril de 35 mm y picar con escalpelos (figura 1C, D). Mince con aproximadamente 40 golpes hasta que el tejido se relaja y se obtienen piezas que no son más grandes que aproximadamente 1 mm2 en el área.
  6. Transferencia a la solución de colagenasa en un tubo de centrifugación de 50 mL. La solución de collagenasa consiste en 2 mg/mL de colagenasa (ver tabla de materiales), 2 mg/ml de tripsina, 5% v/v suero bovino fetal (FBS), 5 μg/ml de insulina y 50 μg/ml de gentamicina en medios DMEM/F12. Utilice una solución de colagenasa de 10 mL por ratón.
  7. Colocar en un baño de agua a 37 ° c, vórtex cada 10 min para 30-60 min. la digestión se completa cuando la solución de colagenasa está turbia (Figura 1E, F).
  8. Gire hacia abajo la solución digerida a 450 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Se observarán tres capas. El sobrenadante está compuesto de grasa, la capa media es una solución acuosa, y la parte inferior es un pellet. El pellet aparecerá de color rojo, ya que es una mezcla de células epiteliales, células estrales individuales y glóbulos rojos (figura 1g).
  9. Precapa todas las pipetas, puntas de piletas y tubos de centrifugación con la solución de albúmina sérica bovina (BSA) antes del contacto. La solución de BSA consiste en 2,5 w/v% BSA en el fosfato amortiguado de Dulbecco (DPBS). Para el recubrimiento previo, basta con añadir a continuación, retire la solución de BSA en el interior de la punta de la Piera y tubos. La solución de BSA se puede reutilizar, aunque debe filtrarse estéril antes de cada experimento.
  10. Para la recuperación adicional, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo recubierto de BSA 15 mL. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para dispersar la capa grasa. Centrifugar a 450 x g durante 10 min al RT. aspirar el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de medios en el tubo para evitar aspirar el pellet de la célula.
  11. Aspiran la capa acuosa desde el tubo con el pellet original.
  12. Añadir 10 mL de DMEM/F12 al tubo con el pellet original y transferirlo al segundo tubo. Pipetear vigorosamente para combinar y resuspender los dos gránulos.
  13. Centrifugar a 450 x g durante 10 min al RT. aspirar el sobrenadante y añadir 4 ml de DMEM/F12 al tubo.
  14. Añadir 40 μL de desoxiribonuclease (DNase) a la suspensión y agitar suavemente con la mano durante 2-5 min en RT. la solución de DNase consta de 4 DNase de U/mL en DMEM/F12.
  15. Añadir 6 mL de DMEM/F12 y pipetear a fondo. Centrifugar el tubo a 450 x g durante 10 min en RT.
  16. Aspirar sobrenadante a la marca de 0,5 mL. Resuspend en 10 mL de DMEM/F12 y pipetear a fondo.
  17. Pulse para 450 x g y parada 4 s después de alcanzar esa velocidad.
  18. Repita los pasos 1.16-1.17 tres veces más para purificar los organoides mediante la diferenciación centrífuga. El pellet debe ser ahora un color blanquecino consistente en organoides epiteliales (figura 1H).
    Nota: los organoides también se pueden filtrar mediante filtros de malla estéril de 40 μm. Después del paso 1,16, los medios de pipetas que contienen organoides a través de un filtro en un tubo centrífugo, y luego enjuagar con 5 a 10 mL de medios DMEM/F12. Voltear el filtro sobre un nuevo tubo de centrifugación de 50 mL. Pase 10 mL de medios DMEM/F12 a través, yendo de la manera opuesta para enjuagar cualquier retentate. El concentrado debe consistir en organoides, y el filtrado debe consistir principalmente de células estrales, que pueden ser desechadas o mantenidas si se desea.

2. determinación de la densidad y los organoides de chapado

  1. Resuspend pellet en 10 mL de DMEM/F12. Pipetear a fondo para crear una solución homogénea.
  2. Transferir 50 μL a una placa de Petri de 30 mm, y ver bajo un microscopio de contraste de fase a 20x. Cuente el número de organoides con un contador de conteo.
    Nota: aquí las puntas de las pipetas se han utilizado consistentemente con un diámetro mínimo de 457 μm, que es 5-10 veces el diámetro de los organoides que se sembraron. Para transferir volúmenes de 2 mL o más (p. ej., los pasos 1,16 y 2,1), utilice pipetas serológicas con diámetros de punta superiores a 1.500 μm.
  3. Calcule la densidad organoide utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
    La densidad deseada es de 1.000 organoids/mL para simplificar la dilución adicional. Si la densidad es demasiado baja, Centrifugue a 450 x g durante 5 min y Aspire medios. Añadir medios necesarios para llegar a 1.000 organoids/mL, y pipetear a fondo para crear una mezcla homogénea.
    1. Para cultivar organoides en una matriz proteica, los organoides de semilla a una concentración de 1 organoid/L en colágeno tipo 1 se diluyeron al 87% o en la membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm. Mientras trabaje con muestras, Manténgase en hielo.
    2. Para congelar los organoides, transfiera el volumen deseado a un tubo de centrifugación separado. Gire hacia abajo a 450 x g durante 5 min. Aspirate medios, y luego agregue el mismo volumen de 90% FBS/10% DMSO. Resuspend los organoides y luego alícuota en crisotubos. Transferir a-80 ° c, y luego a nitrógeno líquido dentro de una semana.
    3. Para descongelar, calentar en un baño de agua de 37 ° c durante un minuto. Centrifugar a 450 x g durante 5 min, y luego aspirar los medios de congelación. Enjuagar con DPBS estéril, y luego centrifugar de nuevo. Aspiran DPBS y añaden medios organoides.
  4. Pipetear 50 μL (50 organoides) en cada pozo de la placa de baja adherencia (figura 1I).
  5. Añadir 150 μL de medio organoide para que el volumen de trabajo total sea de 200 μL. los medios organoides consisten en 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS) en medios DMEM/F12.
  6. Cada 2 días Reemplace los medios cuidadosamente.
    Nota: las placas de baja adherencia no son tratadas con cultivo de tejidos; por lo tanto, las células se pueden desprenderse fácilmente. Aspiran los medios lentamente inclinando la placa e insertando la punta de la Piera en el borde de cada pozo. Deje una pequeña cantidad de medios en la parte inferior del pozo. Agregue nuevos medios lentamente para evitar la aplicación de fuerzas de cizallamiento innecesarias a los organoides.

3. coculturación con macrófagos

  1. Mantener los macrófagos crudos etiquetados con GFP o dTomato 264,7 en medios DMEM complementados con 10% de FBS y 1% de penicilina-streptomicina. Semilla 1 x 104, 5 x 104, o 1 x 105 células/ml en medio organoide.
  2. Utilice el contraste de fase de células vivas y la imagen fluorescente para monitorear la infiltración de macrófagos con el tiempo.

4. tinción de inmunofluorescencia de organoides

Nota: los organoides se pueden teñir en pozos de baja adherencia o pueden transferirse a portaobjetos de cámara. Para transferir, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que los organoides se hayan desprendido de las placas. Transferir a los portaobjetos de cámara e incubar durante 4-8 h para permitir que los organoides se adhieran a la superficie de la placa.

  1. Retire el medio organoide de los pozos aspirando cuidadosamente. Fije las muestras con un 10% de formalina amortiguada neutral durante 15 min en RT.
  2. Lavar 3x 5 min en 1x PBS. Si se desea, las muestras fijas se pueden almacenar a 4 ° c durante una semana para su posterior tinción.
  3. Permeabilizar con 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetrametilbutilo) fenil-polietilenglicol durante 5 min.
    Nota: para manchar para F-actin, incubar muestras con Phalloidin diluido 1:1000 y 1,67 nM bisbenzimida tinte nuclear en 1% PBS/BSA para 1 h en RT. A continuación, proceda al paso 4,8.
  4. Bermeabilize con 0,5 PBS. Las muestras pueden almacenarse en imágenes 4opy e imágenes inmunofluorescentes. mecanismos que contribuyen al RLOCK CTC con 5% suero de cabra normal en 0,1% PBS/polietilenglicol sorbitán monolaurato (pbst) para 1 h en RT. lavar 3x 5 min con PBS.
  5. Incubar con anti-citoqueratina 14 diluido 1:1000, E-cadherin diluido 1:200, o proteína de Unión apretada uno diluido 1:100 en 1% NGS en PBST para 1 h en RT. lavar 3x 5 min en PBST.
  6. Incubar con cabra anti-conejo secundario diluido 1:200 con 1% NGS/PBST para 1 h en RT. Cubra con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
  7. Lavar 3x 5 min en PBS. Utilice el tinte nuclear (ver tabla de materiales) para manchar los núcleos.
  8. Lavar 3x 5 min en PBS. Si utiliza un portaobjetos de cámara, Monte con un resguardo. Almacenar envuelto en papel de aluminio a 4 ° c durante un máximo de 2 semanas.

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Resultados

Los organoides epiteliales irradiados se obtuvieron con éxito a partir de glándulas mamarias de ratones, procesadas y cultivadas en placas de baja adherencia (figura 1). El rendimiento organoide se probó por siembra en diferentes ambientes de crecimiento (figura 2A-G). Las células de siembra directamente en el cultivo de tejidos tratados con placas de células de 10 cm produjeron un crecimiento excesivo de células de fibroblastos. Los fibroblastos fueron identificados bajo la...

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Discusión

En este protocolo, hemos desarrollado un método para el crecimiento reproducible y la caracterización de los organoides mamarios irradiados (figura 1). Se aplicó una dosis de irradiación de 20 GY para reflejar los modelos anteriores in vivo de reclutamiento de células tumorales5. La irradiación de las glándulas mamarias ex vivo antes de la formación organoide permitió el aislamiento de los efectos de daño por radiación sin una infiltración correspondiente de las célul...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Laura L. Bronsart por proveer los macrófagos RAW 264,7 etiquetados con GFP y dTomato. Esta investigación fue apoyada financieramente por la beca NIH #R00CA201304.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% Formalina tamponada neutraVWR16004-128
Anticitoqueratina 14abcamab181595Lote: GR3200524-3
Albúmina sérica bovinaSigmaA1933-25G
Colágeno tipo ICorning354236
colagenasa de Clostridium Histolyticum, tipo VIIISigmaC2139
Colagenasa IGibco17018029
DMEM/F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-CadherinSeñalización Celular24E10Lote: 13
FBSSigmaF0926
GentamicinaGibco15750
Cabra anti-conejo secundarioab150077verde
Lote: GR3203000-1
Cabra anti-conejo secundarioab150080rojo
Lote: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Lote: TG2611041
Insulina (10 mg/mL)SigmaI9278
Insulina-Transferrina-Selenio, 100xGibco51500-056
Membrana basal Matrigel (membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm)Corning356237
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
Nuclon Sphera Placas de 96 pocillosThermo174927
PBSVWR10128-856
Pluma/estreptococoFisher
Faloidinaabcamab176757Lote: GR3214582-16
Proteína de unión estrecha 1NovusNBP1-85047Lote: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol)SigmaX100-100ML
TripsinaGibco27250-018
Tween-20 (monolaurato de sorbitán de polietilenglicol)SigmaP1379-100ML
15140122

Referencias

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