Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.
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Artículo de método
Disección de la Retina Pupal de Drosophila para inmunohistoquímica, Western análisis y aislamiento de ARN
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de procesos morfogenéticos durante el desarrollo. En este trabajo, presentamos un protocolo confiable para la disección de la delicada retina pupal de Drosophila . Nuestro abordaje utiliza herramientas fácilmente disponibles de microdisección para abrir pupas y precisamente extraer complejos músculo-ojo-cerebro. Estos pueden fijarse, objeto de immunohistochemistry y retinas entonces montados en portaobjetos de microscopio y reflejados si el objetivo es detectar estructuras celulares o subcelulares. Alternativamente, retinas interpretaciones pueden ser aislados del tejido cerebral, lisis en buffers de apropiada y utilizadas para que proteína gel electroforesis o mRNA extracción (evaluar la expresión de la proteína o gen, respectivamente). Paciencia y práctica significativa pueden ser necesario para dominar el protocolo de microdisección descrito, pero una vez dominado, el protocolo permite aislamiento relativamente rápida de retinas principalmente intactas.
Introducción
La retina de Drosophila se compone de aproximadamente 750 ommatidia rodeada de pigmento las células dispuestas en panal enrejado1,2,3,4. Cada ommatidium contiene ocho neuronas fotorreceptoras, cuatro células secretoras de la lente de cono y dos células de pigmento primarias. Que rodean cada ommatidium son células productoras de pigmento de enrejado y los grupos de cerdas sensoriales. Debido a su naturaleza poste-mitotic y arreglo hexagonal estereotipada, la retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente ....
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Protocolo
1. preparación de tejido
- Configurar Drosophila cruza (como se describe anteriormente20) o cepas específicas de Drosophila para obtener pupas del genotipo deseado de la cultura. Para asegurar que un gran número de pupas emerge coincidentemente, establecer estas culturas mosca por duplicado en medios de alimentos ricos en nutrientes o alimentos medios suplidos generosamente con pasta de levadura.
- Mantener cultivos de Drosophila a 25 ° C. Para cruces utilizando el sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 es un conductor ideal expresado en células de ojo larvas disco posteriores al surco morfogenético y des....
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Resultados
El ojo de pupa es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar procesos de desarrollo morfogénesis de la drive. Aquí, nosotros hemos diseccionado retinas y utiliza inmunofluorescencia para detectar las ensambladuras de los adherens apical (Figura 3A, C) o la caspasa Dcp-1 (figura 3D) que se activa durante la apoptosis (figura 3)25. Estos enfoques permiten obser.......
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Discusión
El método de disección de ojo pupal de Drosophila aquí descrito permite el aislamiento de complejos de músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 min. Sin embargo, paciencia y práctica son esenciales para dominar la técnica de disección y mejorar la calidad y velocidad de disecciones. Este tiempo breve disección asegura que cada ojo es aproximadamente la misma etapa de desarrollo, reducir la variabilidad en la expresión del fenotipo o gen de retinas en un conjunto de datos. Mientras protocolos alternativos pueden .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Zack tambor y nuestros revisores para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R15GM114729.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Adobe | Software de procesamiento de imágenes | |
| Férulas de bambú, 6 " | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glicerol fosfato | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Plato de disección negro Placa | Petri de vidrio llena hasta el borde con SYLG170 o SYLG184 (coloreado de negro con polvo de carbón finamente molido). Dejar a temperatura ambiente durante 24-48 h para polimerizar. | ||
| Portacuchillas | Fine Science Tools | 10053 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, sin EDTA, inhibidor de la proteasa comprimidos Roche | 4693132001 | ||
| Microscopio confocal (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | o similar Microscopio | |
| dietil pirocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Cinta adhesiva de doble cara | 3M | 665 | |
| Drosophila medios alimentarios, ricos en nutrientes | 7,5% de sacarosa, 15% de glucosa, 2,5% de agar, 20% de levadura de cerveza, 5% de peptona, 0,125% de MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila medios alimentarios, receta estándar de | harina de maíz Bloomington Drosophila Stock Center. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Solución | formadehído al 4% en PBS, pH 7,4. | ||
| Microscopio de fluorescencia (microscopio TCS SP5 DM) | Leica Microsystems | o microscopio similar | |
| Pinzas | Fine Science Tools | 91150-20 | deben afilarse con frecuencia. |
| Formaldehído | Thermo Scientific | 28908 | |
| Plato de vidrio de 9 pocillos | Corning | 7220-85 | También conocido como platos de 9 pocillos |
| Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Portaobjetos de microscopio de vidrio (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Placa de Petri de vidrio | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Software Image Studio versión 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Software de procesamiento de imágenes para la cuantificación de Western blots. | |
| Tampón de muestra Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | Tampón de muestra de proteína concentrada 2X, suplemento con beta mercaptoetanol según las instrucciones del fabricante. |
| Marcador de carril que reduce el búfer de muestras | Tampón de | Scientific 39000 | 5X. |
| Tubos de microcentrígula | Axygen | MCT-175-C | |
| Fine Science Tools | 15000-03 | ||
| Bandejas de micropocillos (72 x 10 y micro; L pocillos) | Nunc | 438733 | |
| Medios | 0,5% N-propilgalato y 80% glicerol en PBS | ||
| N-propilgalato | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| PBS libre de nucleasas (PBS en 0,1% DEPC, pH 7,4) | Agregue el volumen adecuado de DEPC a PBS, mezcle bien e incube durante la noche a temperatura ambiente con agitación constante. Autoclave durante al menos 20 minutos. Tienda en 4° C | ||
| PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare de acuerdo con las instrucciones del fabricante |
| PBS+pi (PBS más inhibidores de proteasa y fosfatasa) | 10 mM de NaF, 1 mM de fosfato de betaglicerol y 1 mM de Na3VO4 en PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0,15% TritonX y 0,5% albúmina sérica bovina en PBS, pH 7,4 | ||
| Soporte de alfiler | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Anticuerpo primario: cabra anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | Para Western blot. Utilizado a 1:3000 |
| Anticuerpo primario: conejo anti-escisión Dcp-1 | Señalización celular | 9578S | Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:100 |
| Anticuerpo primario: rata anti-DEcad | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | DCAD2 | Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:20 |
| Anticuerpo primario: rata anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Regalo de Tadashi Uemura. Se utiliza a escala 1:100. |
| Kit de extracción de ARN: Relia Prep Kit de minipreparación de tejido de ARN | Promega | Z6110 | |
| Reactivo de descontaminación de rnasa (RNasa Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Hojas de bisturí | Fine Science Tools | 10050 | Rompa un pequeño trozo de hoja de escapala y asegúrelo en el soporte de la hoja. |
| Anticuerpo secundario: 488-conjugado burro anti-rata IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:200 |
| Anticuerpo secundario: cy3 conjugado cabra anti-conejo IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:100 |
| Tecnología de señalización celular | 7077 | anti-rata anti-rata conjugada con HRP | para Western blot. Utilizado a 1:3000 |
| Anticuerpo secundario: IgG (H+L) anticabra de conejo conjugado con HRPJackson | ImmunoResearch | 305-035-003 | Para Western blot. Utilizado en 1:3000 |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoruro de sodio | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Vanadato de sodio | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Espectrofotómetro (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Microscopio estereoscópico de disección (M60 o M80) | Leica Microsystems | o microscopio similar | |
| Sylgard (negro) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparente) | Dow Corning | SYLG184 | Color negro con polvo de charcol finamente molido |
| Tejido: | Kimwipes KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Clorhidrato de Trizma pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Aguja de tungsteno, fina | Fine Science Tools | 10130-10 | Inserto en el soporte de alfileres |
| Aguja de tungsteno, robusta | Fine Science Tools | 10130-20 | Inserto en el soporte de pasadores |
| WTLB (tampón de lisis de tejidos occidental) | 150 mM de NaCl, 1,5 % de Triton X-100, 1 mM de EDTA, 20 % de glicerol, 10 mM de NaF, 1 mM de beta-glicerol de fosfato y 1 mM de Na3VO4 en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Complementar con una mesa de cóctel de proteasas cOmplete por 10 ml de solución. | ||
| Pasta de levadura | (supermercado local) | Aproximadamente 2 cucharadas de levadura ActiveDry de Fleischmann (o similar) disuelta en ~ 20 mL de H2O destilado |
Referencias
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
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Reimpresiones y permisos
