Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Summary

Este protocolo presenta un método para la descelularización y posterior formación de hidrogel de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo.

Abstract

La radiación es una terapia para pacientes con cáncer de mama triple negativo. Se desconoce el efecto de la radiación en la matriz extracelular (ECM) del tejido mamario sano y su papel en la recurrencia local en el sitio del tumor primario. Aquí presentamos un método para la descelularización, liofilización y fabricación de hidrogeles ECM derivados de almohadillas de grasa mamaria murina. Se presentan resultados sobre la eficacia del proceso de descelularización, y se evaluaron los parámetros reológicos. Las células de cáncer de mama etiquetadas por GFP y luciferasse encapsuladas en los hidrogeles demostraron un aumento de la proliferación en hidrogeles irradiados. Finalmente, se empleó la tinción conjugada con phalloidin para visualizar la organización del citoesqueleto de las células tumorales encapsuladas. Nuestro objetivo es presentar un método para la fabricación de hidrogeles para el estudio in vitro que imitan el entorno del tejido mamario in vivo y su respuesta a la radiación con el fin de estudiar el comportamiento de las células tumorales.

Introduction

El cáncer se caracteriza por la proliferación excesiva de células que pueden evadir la apoptosis y también hacer metástasis en sitios distantes¹. El cáncer de mama es una de las formas más comunes entre las mujeres en los Estados Unidos, con un estimadode 266.000 nuevos casos y 40.000 muertes en 2018 2. Un subtipo particularmente agresivo y difícil de tratar es el cáncer de mama triple negativo (TNBC), que carece del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La radioterapia se utiliza comúnmente en el cáncer de mama para eliminar las células tumorale....

Protocol

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y protocolos institucionales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt.

1. Preparación y irradiación ex vivo de los equipos de multifunción

1. Sacrificar ratones Nu/Nu atímicos (8-10 semanas) usando asfixia por_CO2 seguida de luxación cervical.
2. Limpie la piel con 70% de etanol.
3. Recoger almohadillas de grasa mamaria (MFP) de ratones sacrificados usando tijeras preesterilizadas y fórceps en un tubo cónico de 15 ml que contiene medios RPMI completos (RPMI complementado con 1% penici....

Results

Las mFP se descelularizaron tras la irradiación mediante el procedimiento que se muestra en la Figura 1A. Se muestran las mFP de predescelularización (figura1B)y postdescelularización (figura 1C). La descelularización se confirmó utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (H & E), y se utilizó la tinción 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol para evaluar el contenido de lípidos (Figura 2). También se evaluaron las.......

Discussion

Este método de formación de hidrogel depende en gran medida de la cantidad de tejido inicial. Las mFP de murine son pequeñas, y el proceso de descelularización da lugar a una reducción significativa del material (Tabla 1). El proceso se puede repetir con más equipos multifunción para aumentar el rendimiento final. El fresado es otro paso importante que puede conducir a la pérdida de material. Otros han demostrado éxito con un molino criogénico, pero este protocolo se basa enel fre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formol tamponado neutro, cubo con espiga	VWR	16004-128-2-metilbutano
	Alfa Aesar	19387-AR
2000ex Reómetro	TA Instruments	10D4335	reómetro
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A1933-25G-calceína
acetoximetilo (calceína AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430-D-Luciferina
Luciferina Luciérnaga, sal de potasio	Biosynth Chemistry & Biología	L-8820	(S)-4,5-Dihidro-2-(6-hidroxi-2-benzotiazolil)-4-tiazolecarboxílico ácido sal potásica
DPX Mountant para histología	Sigma-Aldrich	06522-500ML-Dulbecco
solución salina tamponada con fosfato	Gibco
14040133-eosina-Y con floxina Homodímero
	Sondas Moleculares, Inc.	E1169	homodímero de etidio-1 (EthD-1)
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	F0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	medio de inclusión de criostato
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	medio de montaje de base acuosa
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	liofilizador
Hoechst 33342 Solución (20 mM)	Thermo Scientific	62249	colorante fluorescente azul
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	258148-500ML-IVIS
Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	sistema de imagen de bioluminiscencia
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		toallitas para tareas delicadas
N-Propanol (sin peróxido/secuenciación), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500-Oil
Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(xililazo)xilil]azo)-2-naftol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Solución salina tamponada con fosfato
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122-Pepsina
de la mucosa gástrica porcina	Sigma-Aldrich	P6887-5G	pepsina
594 Reactivo (ab176757)	abcam	ab176757	conjugado de faloidina
Propilenglicol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K-Richard-Allan
Scientific Signature Series Reactivo azulado	Richard-Allan Scientific	7301L	azulado
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxilina 7211	Richard-Allan Scientific	7211-RPMI
Medio 1640	Gibco	11875-093-Desoxicolato de
sodio, 98%	Frontier Scientific	JK559522	ácido desoxicólico
sacarosa	Sigma-Aldrich	S5016-Triton
x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	em>t-octilfenoxipolietoxietanol
tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol	Gibco	25200-056-Whatman
papel de filtro cualitativo, Grado 4	Whatman	1004-110	papel de filtro cualitativo de grado 4
xilenos (certificado ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-