Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Summary

Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.

Abstract

Las neuronas diferenciadas en el cultivo bidimensional de las células progenitoras neuronales derivadas de células madre humanas (NDC) representan un potente sistema modelo para explorar los mecanismos de la enfermedad y llevar a cabo pruebas de detección de alto contenido (HCS) para interrogar a un compuesto bibliotecas o identificar fenotipos de mutación genética. Sin embargo, con las células humanas la transición de NPC a funcional, neurona madura requiere varias semanas. Las sinapsis suelen comenzar a formarse después de 3 semanas de diferenciación en el cultivo monocapa, y varias proteínas específicas de la neurona, por ejemplo el marcador panneuronal nucina NucN, o el marcador de neurona cortical cerebral CTIP2 de capa 5/6, comienzan a expresar alrededor de 4-5 semanas después de la diferenciación. Este largo tiempo de diferenciación puede ser incompatible con las condiciones de cultivo óptimas utilizadas para plataformas HCS de pequeño volumen y varios pozos. Entre los muchos desafíos se encuentran la necesidad de células bien adheridas y distribuidas uniformemente con agrupamiento celular mínimo y procedimientos de cultivo que fomenten la viabilidad a largo plazo y la maduración funcional de la sinapsis. Un enfoque es diferenciar las neuronas en un formato de gran volumen, luego replacarlas en un momento posterior en multi-pozos compatibles con HCS. Algunos de los principales desafíos al utilizar este enfoque de replacado se refieren a la reproducibilidad y la viabilidad celular, debido a la interrupción estresante de la red dendrítica y axonal. Aquí demostramos un procedimiento detallado y confiable para resuspender enzimáticamente las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) después de su diferenciación durante 4-8 semanas en un formato de gran volumen, transfiriéndolas a microtíterdes de 384 polos placas, y el cultivo de ellos para otros 1-3 semanas con excelente supervivencia celular. Este replato de neuronas humanas no sólo permite el estudio del ensamblaje y maduración de la sinapsis dentro de las dos semanas posteriores al replating, sino que también permite estudios de regeneración de neurita y características del cono de crecimiento. Proporcionamos ejemplos de ensayos escalables para neuritogénesis y sinaptogénesis utilizando una plataforma de 384 pozos.

Introduction

Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina regenerativa. Los flujos de trabajo y procedimientos para optimizar su cultivo y mantenimiento, y mejorar la eficiencia de la diferenciación en subtipos neuronales específicos, están evolucionando rápidamente^1,2. Para mejorar la utilidad y la rentabilidad de las neuronas derivadas de células madre humanas como sistemas modelo susceptibles de análisis de alto contenido en el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos, es útil dismi....

Protocol

1. Período de diferenciación antes de la replacación

1. Diferenciar las neuronas en platos de 10 cm, utilizando un protocolo de elección^7,8 hasta que las neuronas han formado una red gruesa con sus procesos y expresar no sólo los primeros marcadores neuronales como MAP2 o TuJ1, sino también marcadores tardíos como NeuN.
2. Cambiar la mitad del medio de elección cada 4 días durante el proceso de diferenciación neuronal.
   NOTA: Los cambios medios más extensos o frecuentes diluyen los factores tróficos esenciales y podrían desfavorecer la maduración.
   1. Para las neuronas WT1....

Results

El replating de las neuronas derivadas de hiPSCs que se han diferenciado durante varias semanas ofrece varias ventajas. Sin embargo, separar y replacar las neuronas diferenciadas que tienen dendritas y axones largos e interconectados (Figura1A) puede resultar en una fracción alta de neuronas dañadas irreversiblemente.

Como se describe en la sección de protocolo, utilizamos la incubación con una enzima proteolítica para separar las neuronas del sus.......

Discussion

Hemos demostrado un procedimiento directo para la resuspensión y reposición de cultivos neuronales humanos que optimiza la viabilidad, el éxito de la diferenciación y las imágenes subcelulares de una manera que es compatible con plataformas de cribado de alto contenido, y otros ensayos relevantes para el descubrimiento de fármacos. La Figura 6 ilustra el flujo de trabajo general y los ejemplos de dichas aplicaciones.

Aunque aquí nos centramos en las neuronas deriv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
repintado post-fuerte
L-ascórbico	fuerte Sigma	A4403	Agregue 1 mL de caldo de 200 mM a 1 L de medio N2B27
Dibutiril-cAMP	Sigma	D0627	Agregue 1 µ M
Humano BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml concentración final
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Añadir 20 mL a 1 L N2B27 medio
DMEM/F12 con Glutamax	Thermofisher Scientific 31331093		Añadir N2 y distribuir en cónicos de 50 mL; tapas de envoltura de parafilm
Humano GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL concentración final
Glutamax	Thermofisher Scientific 35050038		Añadir 10 ml a 1 L N2B27 medio; suplemento de glutamina
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Añadir 100 µ L a 50 mL N2B27
MEM Aminoácidos no esenciales	Thermofisher Scientific	11140035	Añadir 5 mL a 1 L N2B27 medio N2
(100x) Suplemento	Life Technologies	17502048	Añadir 5 mL a 500 mL de medio
Medios Neurobasal A	Thermofisher Scientific	10888022	Combínelo con DMEM/F12 para generar medios N2B27 para células CVB wt; medios A basales neurales
Medios	neurobasalesThermofisher Scientific	21103049	para células WT126; medio basal neural
SM1 Suplemento	StemCell Technologies	5711	Añadir 1:50 a los medios
Bicarbonato de sodio	Thermofisher Scientific	25080-094	Añadir 10 mL a 1 L N2B27 media
Preparación en placa
10 cm Platos de cultivo de tejidos	Fisher Scientific	08772-E	Platos de plástico tratados con TC
Platos de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Thomas Scientific	1194Y80	Placas NEST
Laminin de ratón	Life Technologies	23017-015	Añadir 1:400 en plástico
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Añadir 1:1.000 en plástico
Agua destilada ultrapura	Life Technologies	10977-015	Para diluir Poly-L-Ornithine
Restrating Reagents
100 mM Filtro de células	Corning	431752	, envuelta individualmente
, sin recubrimiento	PerkinElmer	6007550	Coat con PLO y Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	solución salina
tamponada con fosfato de DulbeccoPlacas de 384 pocillos prerrecubiertas de poli-D-lisina	PerkinElmer	6057500	Enjuague antes de recubrir con laminina
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Aplique una placa de 1 mL/10 cm durante 30-45 min; enzima proteolítica
Materiales de fijación
37% formaldehído	Fisher Scientific	F79-1	disuelto en PBS
Sacarosa	Fisher Scientific	S5-12	0,8 g por 10 mL de fijador
Immunostaining Materials
Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón	Invitrogen	A-11001	anticuerpo secundario
Alexa Fluor 568 Cabra anti-pollo	Invitrogen	A-11041	anticuerpo secundario
Alexa Fluor 647 Cabra anti-pollo	Invitrogen	A-21449	anticuerpo secundario
Alexa Fluor 561 Cabra anti-rata	Invitrogen	A-11077	anticuerpo secundario
DAPI	Biotium	40043	visualiza el ADN
Anticuerpo de ratón contra b3-tubulina (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	marcador neuronal en etapa temprana Anticuerpo
rata contra CTIP2	Abcam	ab18465	capa 5/6 cortical neuronas
Anticuerpo de pollo contra MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	neuronal en etapa temprana
Anticuerpo de pollo contra NeuN	Millipore	ABN91	marcador neuronal en etapa tardía
Anticuerpo de conejo contra MAP2	Shelley Halpain	N/A	marcador neuronal en etapa temprana
Anticuerpo de ratón contra PSD-95	Sigma	P-246	marcador postsináptico
Anticuerpo de conejo contra Sinapsina 1	Millipore	AB1543	marcador presináptico
Albúmina sérica bovina (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% en PBS para bloquear
Titon X-100	Sigma	9002931	Diluido a 0.2% en PBS para permeabilización
Marcadores de viabilidad
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118 marcador de	muerte celular
Calcium Imaging
Nombre del reactivo/equipo Número de	catálogo	la empresa	Comentarios/Descripción
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	reportero de calcio en un sistema de administración
viralhiPSCs derivados de NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	inédito