Evaluación de la lateralización del hemisferio con registro de potencial de campo local bilateral en corteza motora secundaria de ratones

La enfermedad de Alzheimer es la forma más común de demencia^1,2. La deposición de la proteína beta amiloide extracelular (proteína amiloide, A-) y los enredos neurofibrilares intracelulares (NFT) son las principales características patológicas de AD^3,4,5, pero los mecanismos subyacentes a la AD patogénesis siguen siendo en gran medida poco claras. La corteza cerebral, una estructura clave en la cognición y la memoria, se ve afectada en el año⁶d.C., y los déficits motores como la marcha lenta, la dificultad para navegar por el medio ambiente y las alteraciones de la marcha se producen con el avance de^{los 7}años. También se han observado deposiciones de A y enredos neurofibrilares en la corteza premotora (PMC) y en el área motora suplementaria (SMA) en pacientes con AD⁸ y adultos mayores de impacto cognitivo^9,lo que indica la participación de un motor deteriorado en la patogénesis AD.

El cerebro está formado por dos hemisferios cerebrales distintos que se dividen por una fisura longitudinal. Un cerebro sano exhibe asimetrías estructurales y funcionales^10,lo que se llama "lateralización", permitiendo al cerebro hacer frente eficientemente a múltiples tareas y actividades. El envejecimiento se traduce en un deterioro de la cognición y la locomoción, junto con una reducción en la lateralidad cerebral^11,12. Las habilidades motoras del hemisferio izquierdo son fácilmente evidentes en el cerebro sano¹³, pero en el cerebro AD la lateralidad aberrante se produce como consecuencia de la falla de dominio del hemisferio izquierdo asociado con la atrofia cortical izquierda^{14, 15,16}. Por lo tanto, una comprensión de una posible alteración de la lateralización cerebral en la patogénesis ad y los mecanismos subyacentes puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la patogénesis ad y conducir a la identificación de posibles biomarcadores para el tratamiento.

La medición electrofisiológica es un método sensible y eficaz para evaluar los cambios en las actividades neuronales de los animales. La reducción de la asimetría hemisférica en ancianos (HAROLD)¹⁷ ha sido documentada por investigaciones electrofisiológicas con tiempo de transferencia interhemisférica sincronizado, que muestra debilitamiento o ausencia de asimetría hemisférica a la peárica presentada estímulos del habla en los ancianos¹⁸. Utilizando APP/PS1, uno de los modelos de ratón AD más utilizados^19,20,21,22, en combinación con el registro extracelular bilateral in vivo de LFP en M2 izquierdo y derecho, posibles déficits de lateralidad en AD. Además, con una configuración de parámetros sencilla, la función integrada del software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales)proporciona una forma más rápida y sencilla de analizar la sincronización de señales eléctricas que matemáticamente lenguaje de programación complejo, que es amigable para los principiantes con electrofisiología in vivo.

Todos los animales fueron emparejados en condiciones estándar (12 h de luz/oscuridad, ambiente de temperatura constante, libre acceso a alimentos y agua) de acuerdo con las directrices y experimentos del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Los Animales de Laboratorio de China por el comité ético local de la Universidad de Guangzhou. Este es un procedimiento de no supervivencia.

NOTA: Para los datos mostrados en los resultados representativos, los ratones dobles transgénicos APP/PS1 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) y los controles de tipo salvaje (WT) de tipo littermate a 3-5 meses de edad, se utilizaron para grabaciones (n .10, por grupo).

1. Anestesia animal y cirugía

1. Pesar y anestesiar el ratón por su régimen de anestesia aprobado de su comité local de cuidado de animales.
2. Realice un pellizco de cola o dedo del rato con fórceps para confirmar la anestesia profunda antes de la cirugía.
3. Coloque el ratón en un aparato estereofólico y fije su cabeza.
4. Aplique un pomada en ambos ojos para mantenerse húmedos. Siga las pautas locales de cuidado de animales con respecto a la analgesia pre y postoperatoria.
5. Afeitar el cabello con cortadoras quirúrgicas. Hacer una pequeña incisión (12-15 mm) en el centro del área quirúrgica expuesta con tijeras. Con fórceps, tire suavemente del cuero cabelludo lejos de la línea media.
6. Separe suavemente la piel y retire el tejido residual. Limpie el cráneo con cogollos de algodón recubiertos de peróxido de hidrógeno.
7. Taladre dos pequeños orificios de radios de 1,0-1,5 mm en ambos lados izquierdo y derecho del cráneo para permitir la inserción de los microelectrodos de grabación en las regiones M2 bajo un estereomicroscopio (Figura1A).
   NOTA: Ubicaciones estereoofilasdes de M2 bilateral: 1,94 mm antes del bregma, 1,0 mm laterales a la línea media y 0,8-1,1 mm ventral a la dura.
8. Retire la dura mater cuidadosamente con una aguja de tungsteno.
9. Tire de micropipetas de borosilicato de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm) como microelectrodos de grabación con resistencia de 1-2 M.
10. Inserte dos microelectrodos de grabación separados llenos de NaCl de 0,5 M en los orificios utilizando micromanipuladores mecánicos (a 60o, Figura 1B).

2. Grabaciones de LFP en M2 bilateral de ratones

1. Baje los electrodos de vidrio izquierdo y derecho lentamente en las coordenadas apropiadas de M2 bilateral (Figura1C).
2. Para el control de calidad, pruebe la resistencia de cada electrodo utilizando el amplificador diferencial antes de capturar LOS LfP.
3. Ajuste el proceso de grabación a paso alto de 0,1 Hz y paso bajo de 1.000 Hz con amplificación de 1.000x.
4. Recopilar datos digitalizados de LFP crudos de al menos 60 s actividades espontáneas en estado estable, con ratones respirando uniformemente a una frecuencia respiratoria de 2 respiraciones por segundo bajo anestesia.
5. Después de la grabación, levante lentamente los electrodos del cerebro, luego eutanasia a los ratones por dislocación cervical rápida.
6. Guarde los datos y analice sin conexión.

3. Análisis de correlación cruzada

1. Haga clic en Análisis - Correlación de forma de onda en el software de análisis e importe los datos.
2. Configuración de parámetros
   1. Defina una señal de canal de forma de onda como el primer canal y la otra como referencia. Establezca la anchura como 2 y desfase como 1 (Figura2A).
   2. Establezca la duración de ambos PPP para 100 s seleccionando la hora de inicio y la hora de finalización. Pulse el botón Procesar para realizar el análisis de correlación cruzada (Figura2B).
      NOTA: Las señales bilaterales simultáneas con tales duraciones serían lo suficientemente largas como para mostrar actividades neuronales espontáneas, revelando así las propiedades básicas de sincronización.
3. Haga clic en Archivo - Exportar comoy, a continuación, guarde los resultados de correlación cruzada correspondientes al gráfico emergente resultante en formato .txt.
4. Abra el archivo .txt (Figura2C), elimine los valores de correlación en el tiempo de desniveles de 0 a 0,01 s (ya que dos ondas gamma continuas tienen al menos un intervalo de 0,01 s), luego promediael el resto de los datos de correlación cruzada en la parte de retraso de tiempo negativa o promedio el resto de los datos de correlación cruzada en la parte positiva del retraso de tiempo.

4. Análisis de coherencia

1. Importe y ejecute los datos en el software de análisis.
2. Asigne las dos señales LFP para que sean los canales de forma de onda primero y segundo por separado. A continuación, establezca el valor de tamaño de bloque (Figura 3A).
   NOTA: Tamaño de bloque significa el número de puntos de datos utilizados en el FFT. Cuanto mayor sea el tamaño del bloque, mejor será la resolución de frecuencia. Aquí recomendamos establecerlo como 4096.
3. Mueva las líneas punteadas manualmente para asegurarse de que la precisión de tiempo de las señales en ambos canales se establece como el mismo período (Figura3B). Pulse el botón Añadir área para cargar el área y realizar un análisis de coherencia.
4. Haga clic en Archivo - Guardar como para guardar los resultados de coherencia correspondientes al gráfico emergente resultante en formato .txt ( Figura3B).

Para ver si la patología temprana de la AD afecta la capacidad de lateralización del hemisferio, realizamos grabaciones bilaterales de LFP extracelulares en el M2 izquierdo y derecho de los ratones APP/PS1 y los controles WT (de 3 a 5 meses de edad), y analizamos la correlación cruzada de estos PFP derecho. En ratones WT, los resultados demostraron que la correlación media entre los PFP izquierdo y derecho en los retrasos positivos difería significativamente de la que en los retrasos negativos en el tiempo, lo que implicaba la existencia de asimetrías hemisféricas en áreas M2 de controles WT (Figura4 C; WT-positivo, 0.08161 a 0.01246; WT-negativo, 0.0206 a 0.01218; p 4.74531E-4 < 0.001 por una prueba dedos muestras t). En comparación, los PFP izquierdo y derecho de los ratones APP/PS1 mostraron una mayor sincronización en el dominio del tiempo, lo que sugiere una reducción de la asimetría entre el M2 izquierdo y derecho (Figura4C; APP/PS1-positivo, 0.13336 a 0.0105 APP/PS1-negativo, 0.12635 a 0.01066; p - 0,64157 > 0,05 por una prueba tde dos muestras).

A continuación, filtramos las oscilaciones gamma de los PFP (Figura5A)y realizamos un análisis de coherencia como se describe en el protocolo para medir la similitud de las señales eléctricas en el rango de frecuencia gamma. El resultado mostró que la coherencia gamma entre m2 izquierdo y derecho en APP/PS1 fue significativamente mayor que la de los ratones WT (Figura5B,C; WT, 0.13267 a 0.00598; APP/PS1, 0.17078 a 0.0072; p - 0.00550 < 0.01 por dos muestrat-test), indicando una mayor sincronización, y por lo tanto reducida la lateralización, entre la izquierda y la derecha M2 en ratones APP/PS1.

Figura 1 : Diagrama del procedimiento de grabación simultánea de LFP. (A) Ratón estereotaxico con cráneo expuesto y dura mater retirado para la grabación bilateral in vivo de LFP en M2 izquierdo y derecho. (B) Dos microelectrodos de vidrio en contacto con la superficie cortical en el agujero perforado simultáneamente. (C) Grabación de microelectrodos junto con los cables Ag/AgCl como electrodos de referencia colocados en los sitios apropiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Ilustración del análisis entre correlaciones. (A) Configuración del cuadro de diálogo de correlación de forma de onda. Esto proporciona opciones para elegir qué canal de forma de onda es la referencia y para analizar la correlación de dos señales. (B) El cuadro de diálogo de proceso. Esto proporciona opciones para establecer la longitud de tiempo de la forma de onda de referencia y se añadirá la duración de otra forma de onda. El análisis solo se realiza para las regiones de datos en las que existen ambos canales de forma de onda. (C) Ejemplo de archivo .txt con valores de correlación cruzada en intervalos de retraso de tiempo negativos y positivos por separado para las estadísticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Ilustración del análisis de coherencia. (A) Configuración de parámetros para el cuadro de diálogo de coherencia. El tamaño de bloque determina el número de puntos de datos utilizados en el análisis y la resolución de frecuencia. (B) Las líneas punteadas son ajustables para que el operador se mueva manualmente con el fin de establecer la duración de las señales para el análisis. (C) Después de que el software haya creado un gráfico, haga clic en Archivo - Guardar como para guardar los resultados de coherencia como un archivo con la extensión de nombre de archivo .txt . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : La correlación cruzada indica la lateralización del hemisferio declinada entre m2 izquierdo y derecho de ratones APP/PS1. (A) Rastros brutos representativos de PFP registrados simultáneamente en ratones bilaterales M2 y APP/PS1 utilizando el método de registro extracelular (L: M2 izquierdo; R: derecha M2). (B) La curva de correlación cruzada muestra la correlación de las señales LFP bilaterales en diferentes retrasos de tiempo. (C) Entre M2 izquierdo y derecho, los controles WT mostraron un valor de correlación cruzada significativamente mayor en intervalos de desajustes de tiempo positivos que los negativos. Por el contrario, el valor de correlación cruzada de los ratones APP/PS1 tiene una similitud, lo que indica una disminución de la asimetría (n a 10, por grupo). El valor representa la media de la media. p < 0.001; dos muestras t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Coherencia de las oscilaciones gamma entre los ratones M2 izquierdo y derecho de los ratones WT y APP/PS1. (A) Rastros representativos de oscilaciones gamma filtradas de Los PFP en M2 izquierdo y derecho. (B) Distribución de coherencia entre PFP simultáneamente registrada en M2 bilateral. Los ratones APP/PS1 difieren en gran medida de los controles WT en el rango de frecuencia gamma. (C) La coherencia entre las oscilaciones gamma de M2 bilateral en
Los ratones APP/PS1 son significativamente más altos que los controles WT (n a 10, por grupo). El valor representa la media de la media. **, p < 0.01; dos muestras t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.