Method Article

Evaluación de la lateralización del hemisferio con registro de potencial de campo local bilateral en corteza motora secundaria de ratones

DOI:

10.3791/59310

⸱

July 31st, 2019

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, South China Normal University, 3School of Life Sciences, South China Normal University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un registro electrofisiológico in vivo del potencial de campo local (LFP) en la corteza motora secundaria bilateral (M2) de ratones, que se puede aplicar para evaluar la lateralización del hemisferio. El estudio reveló niveles alterados de sincronización entre la izquierda y la derecha M2 en ratones APP/PS1 en comparación con los controles WT.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo demuestra procedimientos completos y detallados para el registro bilateral in vivo y el análisis del potencial de campo local (LFP) en las áreas corticales de ratones, que son útiles para evaluar posibles déficits de lateralidad, así como para la conectividad cerebral y el acoplamiento de las actividades de las redes neuronales en roedores. Los mecanismos patológicos subyacentes a la enfermedad de Alzheimer( AD), una enfermedad neurodegenerativa común, siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha demostrado la lateralidad cerebral alterada en personas envejecidas, pero no se ha determinado si la lateralización anormal es uno de los primeros signos de AD. Para investigar esto, registramos PFP bilaterales en ratones modelo AD de 3-5 meses, APP/PS1, junto con controles de tipo salvaje (WT). Los PFP de la corteza motora secundaria izquierda y derecha (M2), específicamente en la banda gamma, estaban más sincronizados en ratones APP/PS1 que en los controles WT, lo que sugiere una disminución de la asimetría hemisférica de M2 bilateral en este modelo de ratón AD. En particular, los procesos de registro y análisis de datos son flexibles y fáciles de llevar a cabo, y también se pueden aplicar a otras vías cerebrales al realizar experimentos que se centran en circuitos neuronales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Alzheimer es la forma más común de demencia1,2. La deposición de la proteína beta amiloide extracelular (proteína amiloide, A-) y los enredos neurofibrilares intracelulares (NFT) son las principales características patológicas de AD3,4,5, pero los mecanismos subyacentes a la AD patogénesis siguen siendo en gran medida poco claras. La corteza cerebral, una estructura clave en la cognición y la memoria, se ve afectada en el año6d.C., y los déficits motores como la marcha lenta, la dificultad para navegar por el medio ambiente y las alteraciones de la marcha se producen con el avance delos 7años. También se han observado deposiciones de A y enredos neurofibrilares en la corteza premotora (PMC) y en el área motora suplementaria (SMA) en pacientes con AD8 y adultos mayores de impacto cognitivo9,lo que indica la participación de un motor deteriorado en la patogénesis AD.

El cerebro está formado por dos hemisferios cerebrales distintos que se dividen por una fisura longitudinal. Un cerebro sano exhibe asimetrías estructurales y funcionales10,lo que se llama "lateralización", permitiendo al cerebro hacer frente eficientemente a múltiples tareas y actividades. El envejecimiento se traduce en un deterioro de la cognición y la locomoción, junto con una reducción en la lateralidad cerebral11,12. Las habilidades motoras del hemisferio izquierdo son fácilmente evidentes en el cerebro sano13, pero en el cerebro AD la lateralidad aberrante se produce como consecuencia de la falla de dominio del hemisferio izquierdo asociado con la atrofia cortical izquierda14, 15,16. Por lo tanto, una comprensión de una posible alteración de la lateralización cerebral en la patogénesis ad y los mecanismos subyacentes puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la patogénesis ad y conducir a la identificación de posibles biomarcadores para el tratamiento.

La medición electrofisiológica es un método sensible y eficaz para evaluar los cambios en las actividades neuronales de los animales. La reducción de la asimetría hemisférica en ancianos (HAROLD)17 ha sido documentada por investigaciones electrofisiológicas con tiempo de transferencia interhemisférica sincronizado, que muestra debilitamiento o ausencia de asimetría hemisférica a la peárica presentada estímulos del habla en los ancianos18. Utilizando APP/PS1, uno de los modelos de ratón AD más utilizados19,20,21,22, en combinación con el registro extracelular bilateral in vivo de LFP en M2 izquierdo y derecho, posibles déficits de lateralidad en AD. Además, con una configuración de parámetros sencilla, la función integrada del software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales)proporciona una forma más rápida y sencilla de analizar la sincronización de señales eléctricas que matemáticamente lenguaje de programación complejo, que es amigable para los principiantes con electrofisiología in vivo.

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Protocol

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Todos los animales fueron emparejados en condiciones estándar (12 h de luz/oscuridad, ambiente de temperatura constante, libre acceso a alimentos y agua) de acuerdo con las directrices y experimentos del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Los Animales de Laboratorio de China por el comité ético local de la Universidad de Guangzhou. Este es un procedimiento de no supervivencia.

NOTA: Para los datos mostrados en los resultados representativos, los ratones dobles transgénicos APP/PS1 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) y los controles de tipo salvaje (WT) de tipo littermate a 3-5 meses de edad, se utilizaron para grabaciones (n .10, por grupo).

1. Anestesia animal y cirugía

  1. Pesar y anestesiar el ratón por su régimen de anestesia aprobado de su comité local de cuidado de animales.
  2. Realice un pellizco de cola o dedo del rato con fórceps para confirmar la anestesia profunda antes de la cirugía.
  3. Coloque el ratón en un aparato estereofólico y fije su cabeza.
  4. Aplique un pomada en ambos ojos para mantenerse húmedos. Siga las pautas locales de cuidado de animales con respecto a la analgesia pre y postoperatoria.
  5. Afeitar el cabello con cortadoras quirúrgicas. Hacer una pequeña incisión (12-15 mm) en el centro del área quirúrgica expuesta con tijeras. Con fórceps, tire suavemente del cuero cabelludo lejos de la línea media.
  6. Separe suavemente la piel y retire el tejido residual. Limpie el cráneo con cogollos de algodón recubiertos de peróxido de hidrógeno.
  7. Taladre dos pequeños orificios de radios de 1,0-1,5 mm en ambos lados izquierdo y derecho del cráneo para permitir la inserción de los microelectrodos de grabación en las regiones M2 bajo un estereomicroscopio (Figura1A).
    NOTA: Ubicaciones estereoofilasdes de M2 bilateral: 1,94 mm antes del bregma, 1,0 mm laterales a la línea media y 0,8-1,1 mm ventral a la dura.
  8. Retire la dura mater cuidadosamente con una aguja de tungsteno.
  9. Tire de micropipetas de borosilicato de vidrio (diámetro exterior: 1,0 mm) como microelectrodos de grabación con resistencia de 1-2 M.
  10. Inserte dos microelectrodos de grabación separados llenos de NaCl de 0,5 M en los orificios utilizando micromanipuladores mecánicos (a 60o, Figura 1B).

2. Grabaciones de LFP en M2 bilateral de ratones

  1. Baje los electrodos de vidrio izquierdo y derecho lentamente en las coordenadas apropiadas de M2 bilateral (Figura1C).
  2. Para el control de calidad, pruebe la resistencia de cada electrodo utilizando el amplificador diferencial antes de capturar LOS LfP.
  3. Ajuste el proceso de grabación a paso alto de 0,1 Hz y paso bajo de 1.000 Hz con amplificación de 1.000x.
  4. Recopilar datos digitalizados de LFP crudos de al menos 60 s actividades espontáneas en estado estable, con ratones respirando uniformemente a una frecuencia respiratoria de 2 respiraciones por segundo bajo anestesia.
  5. Después de la grabación, levante lentamente los electrodos del cerebro, luego eutanasia a los ratones por dislocación cervical rápida.
  6. Guarde los datos y analice sin conexión.

3. Análisis de correlación cruzada

  1. Haga clic en Análisis - Correlación de forma de onda en el software de análisis e importe los datos.
  2. Configuración de parámetros
    1. Defina una señal de canal de forma de onda como el primer canal y la otra como referencia. Establezca la anchura como 2 y desfase como 1 (Figura2A).
    2. Establezca la duración de ambos PPP para 100 s seleccionando la hora de inicio y la hora de finalización. Pulse el botón Procesar para realizar el análisis de correlación cruzada (Figura2B).
      NOTA: Las señales bilaterales simultáneas con tales duraciones serían lo suficientemente largas como para mostrar actividades neuronales espontáneas, revelando así las propiedades básicas de sincronización.
  3. Haga clic en Archivo - Exportar comoy, a continuación, guarde los resultados de correlación cruzada correspondientes al gráfico emergente resultante en formato .txt.
  4. Abra el archivo .txt (Figura2C), elimine los valores de correlación en el tiempo de desniveles de 0 a 0,01 s (ya que dos ondas gamma continuas tienen al menos un intervalo de 0,01 s), luego promediael el resto de los datos de correlación cruzada en la parte de retraso de tiempo negativa o promedio el resto de los datos de correlación cruzada en la parte positiva del retraso de tiempo.

4. Análisis de coherencia

  1. Importe y ejecute los datos en el software de análisis.
  2. Asigne las dos señales LFP para que sean los canales de forma de onda primero y segundo por separado. A continuación, establezca el valor de tamaño de bloque (Figura 3A).
    NOTA: Tamaño de bloque significa el número de puntos de datos utilizados en el FFT. Cuanto mayor sea el tamaño del bloque, mejor será la resolución de frecuencia. Aquí recomendamos establecerlo como 4096.
  3. Mueva las líneas punteadas manualmente para asegurarse de que la precisión de tiempo de las señales en ambos canales se establece como el mismo período (Figura3B). Pulse el botón Añadir área para cargar el área y realizar un análisis de coherencia.
  4. Haga clic en Archivo - Guardar como para guardar los resultados de coherencia correspondientes al gráfico emergente resultante en formato .txt ( Figura3B).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para ver si la patología temprana de la AD afecta la capacidad de lateralización del hemisferio, realizamos grabaciones bilaterales de LFP extracelulares en el M2 izquierdo y derecho de los ratones APP/PS1 y los controles WT (de 3 a 5 meses de edad), y analizamos la correlación cruzada de estos PFP derecho. En ratones WT, los resultados demostraron que la correlación media entre los PFP izquierdo y derecho en los retrasos positivos difería significativamente de la que en los retrasos negativos en el tiempo, lo que implic...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí informamos del procedimiento para el registro extracelular bilateral in vivo, junto con el análisis de la sincronización de señales LFP de dos regiones, que es flexible y fácil de llevar a cabo para estimar la lateralización del hemisferio cerebral, así como el conectividad, direccionalidad o acoplamiento entre las actividades neuronales de dos áreas cerebrales. Esto puede ser ampliamente utilizado para revelar no sólo actividades de grupo-neuronal, sino también algunas propiedades básicas de la electrofisi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771219, 31871170), la División de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2013KJCX0054), y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amplificador diferencial AC/DCA-M Systemsmodelo 3000
Convertidor digital analógicoCambridge Electronic Design Ltd.Micro1401
Micropipetas de borosilicato de vidrio Compañíade equipos experimentales de enseñanza de resorte de Nanjing161230Diámetro exterior: 1,0 mm
Extractor de microelectrodosNarishigePC-10
NaClFábrica de reactivos químicos de Guangzhou7647-14-5
Soporte de microelectrodo de pinWorld Precision Instruments, INC.
Spike2 Diseño Electrónico de Cambridge Ltd.
Microscopio estereoscópicoZeiss435064-9020-000
Aparato estereotáxico RWD Life Science68045
UretanoSigma-Aldrich94300
MEH3SW10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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