Estudio sobre el metabolismo de seis insecticidas sistémicos en un cultivo de suspensión celular recién establecido derivado del té (Camellia Sinensis L.) Hojas

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo para establecer un cultivo de suspensión celular derivado del té (Camellia sinensis L.) hojas que se pueden utilizar para estudiar el metabolismo de los compuestos externos que pueden ser tomados por toda la planta, como insecticidas.

Resumen

Se desarrolló una plataforma para estudiar el metabolismo de insecticidas utilizando tejidos in vitro de la planta de té. Las hojas de las plantas de té estéril fueron inducidas a formar callos sueltos en murashige y Skoog (MS) medios basales con las hormonas vegetales 2,4-ácido diclorofenoxacetico (2,4-D, 1,0 mg L^-1) y kinetina (KT, 0,1 mg L^-1). Callus se formó después de 3 o 4 rondas de subcultura, cada una con una duración de 28 días. El callo suelto (alrededor de 3 g) se inoculó en medios líquidos B5 que contenían las mismas hormonas vegetales y se cultivaba en una incubadora de temblores (120 rpm) en la oscuridad a 25 oC. Después de 3 x 4 subcultivos, se estableció una suspensión celular derivada de la hoja de té en una relación subcultal que oscila entre 1:1 y 1:2 (líquido madre de suspensión: medio fresco). Usando esta plataforma, se añadieron seis insecticidas (5 g de ml^-1 cada tiametoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimetoato y omethoato) al cultivo de suspensión celular derivado de la hoja de té. El metabolismo de los insecticidas fue rastreado mediante cromatografía líquida y cromatografía de gases. Para validar la utilidad del cultivo de suspensión de células de té, los metabolitos de tiametoxano y dimetoato presentes en cultivos celulares tratados y plantas intactas se compararon utilizando espectrometría de masas. En los cultivos de células de té tratadas, se encontraron siete metabolitos de tiametoxano y dos metabolitos de dimetoato, mientras que en las plantas intactas tratadas, sólo se encontraron dos metabolitos de tiametoxam y uno de dimetoato. El uso de una suspensión celular simplificó el análisis metabólico en comparación con el uso de plantas de té intactas, especialmente para una matriz difícil como el té.

Introducción

El té es una de las bebidas no alcohólicas más consumidas en el mundo^1,2. El té se produce a partir de las hojas y cogollos de la perley perenne Camellia sinensis L.Las plantas de té se cultivan en vastas plantaciones y son susceptibles a numerosas plagas de insectos 3,^4. Los insecticidas organofosforados y neonicotinoides se utilizan a menudo como insecticidas sistémicos⁵ para proteger las plantas de té de plagas como las moscas blancas, las tolvas de hojas y algunas especies de lepidópteros⁶

Protocolo

1. Cultura callo del té

NOTA: Las hojas estériles se derivaron de líneas de plantlet cultivadas in vitro desarrolladas por primera vez en el grupo de investigación^17. Todos los procedimientos hasta la sección 5 se llevaron a cabo en una campana de flujo laminar estéril, excepto por el tiempo de cultivo en una incubadora.

1. Ajustar el pH de los dos medios (Murashige y Skoog [MS] medio basal y medio líquido B5 de Gamborg) a 5.8 antes de autoclave (121 oC, 20 min).
2. Cortar a lo largo de la vena media de una hoja estéril usando tijeras, y luego subdividir cada mitad en pequeños trozos de aproximadamente ....

Resultados

La inducción de callos a partir de hojas cosechadas a partir de árboles de té cultivados en el campo y de hojas extirpadas de plantas de té cultivadas in vitro en un ambiente estéril se comparó midiendo la contaminación, el pardeamiento y la inducción después de 28 días de cultivo en medios de aseo ( Figura 1A). El crecimiento del callo se registró en 20, 37, 62 y 90 días de cultivo (Figura1B). El callo derivado de las hojas cult.......

Discusión

Este artículo presenta el proceso detallado de establecer un modelo de metabolismo de pesticidas en el tejido vegetal del té, incluyendo la selección de explantas, la determinación de la viabilidad celular y el establecimiento de un cultivo de suspensión de células de té con alto nivel metabólico Actividad. Cualquier parte de un tejido vegetal podría utilizarse para iniciar el callo en un ambiente esterilizado^25. Las hojas de té fueron elegidas para la iniciación del callo en este estudio, no sólo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetamiprid (99.8%)	Dr. Ehrenstorfer	46717	CAS No: 135410-20-7
Acetonitrilo (CAN, 99.9%)	Tedia	AS1122-801	CAS No: 75-05-8
Agar	Solarbio Science & Tecnología	A8190	Nº CAS: 9002-18-0
Clotianidina (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	525	Nº CAS: 210880-92-5
Dimetoato (98,5%)	Dr. Ehrenstorfer	109217	Nº CAS: 60-51-5
Imidacloprid (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	91029	Nº CAS: 138261-41-3
Imidaclothiz (99,5%)	Toronto Research Chemical	I275000	Nº CAS: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%)	Solarbio Ciencia & Tecnología	K8010	Nº CAS: 525-79-1
Ometoato (98,5%)	Dr. Ehrenstorfer	105491	Nº CAS: 1113-02-6
Polivinilopolipirrolidona (PVPP)	Solarbio Ciencia & Tecnología	P8070	Nº CAS: 25249-54-1
Sacarosa	Tocris Bioscience	5511	Nº CAS: 57-50-1
Tiametoxam (99,8%)	Dr. Ehrenstorfer	20625	Nº CAS: 153719-23-4
Cloruro de trifeniltetrazolio (TTC, 98,0%)	Solarbio Ciencia & Tecnología	T8170	Nº CAS: 298-96-4
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, >98,0%)	Guangzhou Saiguo Biotech	D8100	Nº CAS: 94-75-7
columna quiral	Agilent CYCLOSIL-B	112-6632 Columna de	cromatografía (30 m &veces; 0,25 mm &veces; 0,25 μ m)
Cromatografía de gases (GC)	Shimadu	2010-Plus	emparejado con detector fotométrico de llama (FPD)
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)	Agilent	1260	Emparejado con detector ultravioleta (UV)
Columna HSS T3 C18 Columna de	186003539	de Waters	(100 mm y veces; 2,1 mm y veces; 1,8 μ m)
Cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC)	Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar en tándem	Agilent	1290-6545
Cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC)	Thermo Scientific	Ultimate 3000-Q Exactive	Focus conectado a un espectrómetro de masas Orbitrap

cromatografía (QTOF)