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Artículo de método

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

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DOI:

10.3791/59314

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9 de abril de 2019

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1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.

Resumen

Rastreo en una secuencia de vídeo y el posterior análisis de sus trayectorias de partículas hoy en día es una operación común en muchos estudios biológicos. Usando el análisis del receptor de membrana de la célula de clusters como un modelo, presentamos un protocolo detallado para esta tarea de análisis de imagen con Fiji (ImageJ) y rutinas Matlab para: 1) definir regiones de interés y diseñar máscaras adaptadas a estas regiones; 2) rastrear las partículas en los videos de la microscopia de fluorescencia; 3) analizar las características de difusión y la intensidad de las pistas. El análisis cuantitativo de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y el tamaño de cluster obtenida por microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes proporciona una herramienta valiosa para determinar objetivamente la dinámica de la partícula y las consecuencias de la modificación de condiciones ambientales. En este artículo presentamos protocolos detallados para el análisis de estas características. El método descrito aquí no sólo permite la detección de una sola molécula de seguimiento, pero también automatiza la estimación de los parámetros de difusión lateral en la membrana celular, clasifica el tipo de trayectoria y permite análisis completo superando así la dificultades para cuantificar el tamaño de punto durante su trayectoria entera en la membrana celular.

Introducción

Proteínas de la membrana incrustadas en la bicapa lipídica están en continuo movimiento debido a la difusión térmica. Sus dinámicas son esenciales para regular las respuestas celular, Interacciones intermoleculares permiten la formación de complejos que varían en tamaño desde monómeros oligómeros e influir en la estabilidad de complejos de señalización. Elucidar los mecanismos que controlan la dinámica de la proteína es así un nuevo reto en la biología de la célula, necesario para entender las vías de transducción de señal y para identificar funciones imprevistas.

Se han desarrollado algunos métodos ópticos para el estudio de estas interacciones en la vida de las células1. Entre estos, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, desarrollado en la década de 1980, permite el estudio de las interacciones moleculares en o muy cerca de la membrana de la célula2. Para estudiar los parámetros dinámicos de las trayectorias de la proteína de membrana obtenidas de TIRF datos en células vivas, se requiere una sola partícula (SPT) del método de seguimiento. Aunque para esto existen varios algoritmos, utilizamos actualmente las publicadas por Jaqaman et al.3 dirección heterogeneidad del movimiento de partículas en un campo de partículas densas uniendo partículas entre fotogramas consecutivos para conectar la pista resultante segmentos en trayectorias completadas (desaparición de partículas temporales). El software captura la partícula combinar y dividir ese resultado de agregación y disociación de eventos3. Uno de los datos de salida de este software es la detección de las partículas a lo largo de la trayectoria entera definiendo sus posiciones X e Y en cada fotograma.

Una vez que las partículas se detectan, se aplican diferentes algoritmos para determinar el intervalo corto difusión coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando el análisis de espectro de escalamiento de momento (MSS)6,7,8 o ajustando el valor de 'alpha' por ajuste de desplazamiento cuadrático medio (MSD) a la curva9, también clasificar las partículas según el tipo de trayectoria.

Análisis de intensidad de la mancha en imágenes de fluorescencia es un objetivo compartido por los científicos en el campo10,11. El algoritmo más común utilizado es el número llamado y el brillo. Este método, sin embargo, no permite detección de correcta intensidad del cuadro a cuadro en las partículas en la fracción móvil. Así, hemos generado un nuevo algoritmo para evaluar estas partículas intensidades fotograma por fotograma y para determinar su estado de agregación. Una vez que las coordenadas de cada partícula se detectan utilizando U-Track2 software3, definimos su intensidad en cada fotograma sobre la trayectoria completa, teniendo en cuenta también el fondo de la celda en cada fotograma. Este software ofrece diferentes posibilidades para determinar la intensidad de la mancha y el fondo de la célula y utilizando proteínas monoméricas y dimérica conocidas como referencias, calcula el número aproximado de proteínas en la partícula detectada (tamaño del clúster).

En este artículo, describimos una guía cuidadosa para realizar estos tres pasos: 1) detección y seguimiento de las partículas individuales a lo largo de un vídeo de la microscopia de fluorescencia utilizando U-; 2) analizando el coeficiente de difusión instantánea (D1-4) de las partículas y el tipo de movimiento (confinado, libre o dirigido) de partículas con trayectorias largas por SMS; 3) medición de la intensidad de la mancha a lo largo del video corregido por la fluorescencia de fondo estimado para cada punto. Esto permite la estimación del tamaño de racimo y la identificación de los pasos de fotoblanqueo.

El uso de este Protocolo no requiere habilidades especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio con cultivo celular, servicios de microscopia y citometría de flujo. El protocolo utiliza ImageJ o Fiji (una distribución de ImageJ12), U-track3y algunas rutinas de hoc hecho ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Rutinas U-track y ad hoc funcionan sobre Matlab que puede instalarse en cualquier computadora compatible.

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Protocolo

1. preparación de muestras biológicas

  1. Cultivar células de Jurkat en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, NaPyr y L-glutamina (RPMI completo). Células de Electroporate Jurkat (20 x 106 células/400 μL de RPMI 1640 con 10% FCS) con un vector del receptor del chemokine etiquetados GFP monomérico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir su detección mediante microscopía de fluorescencia.
    Nota: Es posible utilizar otras monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etcetera.
  2. 24 h después de la transfección analizar las células en un citómetro de flujo para determinar la viabilidad celular y la expresión de CXCR4-AcGFP.
  3. Seleccionar las células que expresan bajos niveles de CXCR4-AcGFP por célula clasificación de GFPbajo las células positivas (figura 1), como exige la baja expresión de receptores transfected en TIRFM experimentos para garantizar seguimiento sola partícula individual de seguimiento trayectorias de9.
  4. Cuantificar el número de receptores en la superficie celular.
    Nota: Como un ejemplo13, ~ 8.500-22.000 AcGFP etiquetado receptores/célula, corresponden a ~ 2-4.5 μm/partículas2.
  5. Resuspender ordenan las células en RPMI completo e incubar durante al menos 2 h a 37 ° C, 5% CO2. Centrifugar las células (300 x g, 5 min) y suspendidas en tampón TIRF (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
    1. Placas en platos pocillos con fondo de cristal de 35 mm (2-3 x 105 células/plato) con fibronectina (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) en la presencia o ausencia de ligando apropiado (es decir, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incube las células (20 min a 37 ° C, 5% CO2) antes de la adquisición de la imagen.
  6. Realizar experimentos usando un microscopio TIRF, equipado con una cámara EM-CCD, un 100 x objetivo de inmersión en aceite (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA) y un láser de diodo de 488 nm. El microscopio permite el control de la temperatura y la incubación con CO2. Localizar y enfocar las células con las perillas de enfoque grueso y fino, utilizando campo claro para minimizar efectos de fotoblanqueo. Para el ajuste de enfoque fino de modo TIRF utilizar una intensidad de láser de baja, insuficiente para la detección de la solo-partícula, o para inducir efectos de photobleaching (energía del laser de 5%, 28 μW).
  7. Adquirir películas (secuencias de imágenes) de aproximadamente 50 s minimizar el intervalo del tiempo entre los fotogramas. Penetración del campo evanescente debería ser 70-90 nm de profundidad. Guarde las películas adquiridas para cada condición experimental como "LIF" (video.lif).
    Nota: Películas en el ejemplo descrito se adquirieron en el 49% en la energía del laser (2 mW) con un tiempo de exposición de 90 ms y un intervalo de tiempo de 98 m, 49 s (500 fotogramas). Penetración de la onda evanescente seleccionada fue de 90 nm.

2. selección de imágenes y creación de máscaras

  1. Para cada condición experimental (video.lif), crear una nueva carpeta (VideoName) que debe contener diferentes carpetas para cada serie. Cada carpeta contendrá una carpeta "videoSeq" para las imágenes de vídeo y una carpeta de "resultados" de los resultados del análisis. Asegúrese de que la estructura del archivo en este momento es el siguiente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Serie1/videoSeq
    VideoName/Serie1/resultados
    Nota: Del microscopio LIF diferentes archivos se obtienen con varios videos para cada condición de tratamiento (es decir, FN, FN + SDF). "video.lif" corresponde al input.lif archivo de vídeo con todas las adquisiciones películas TIRF (serie) en el microscopio. "videoSeq" carpeta contendrá los 500 marcos de la película que estamos analizando. La carpeta de "resultados" contendrá todos los archivos resultantes de los análisis realizados. Nomenclatura exacta y la localización de las carpetas diferentes son esenciales para el correcto funcionamiento de los algoritmos. Los nombres en negrita en la lista de arriba son fijos (es decir, tienen que ser llamado de esta manera ya que estos son los nombres por las secuencias de comandos). Nombres no en negrita pueden cambiar para reflejar el experimento realizado.
  2. Abrir el video TIRFM (LIF archivo) con Fiji o ImageJ arrastrando y soltando el archivo en la barra de menú de Fiji y haga clic en Aceptar para importar el archivo de lif usando BioFormats (suplementario Figura 1).
  3. Seleccione la serie de procesos y haga clic en Aceptar (figura complementaria 2A). Para diseñar una máscara para el análisis de este video, también importar una imagen multicanal con los cromóforos diferentes (en el ejemplo, la serie 1 es la imagen multicanal y serie 2 el video correspondiente). El video (y la imagen multicanal) deben abrir como una pila de ImageJ. En el ejemplo (suplementario figura 2B), la imagen está a la izquierda y el video está a la derecha.
    Nota: Si no es necesaria la creación de una máscara para el vídeo, vaya a paso 2.5.
  4. Crear una máscara. Crear una imagen con los canales útiles para el diseño de la máscara. En este caso, los canales interesantes son el rojo, verde y gris.
    1. Dividir los canales de la imagen multicanal (suplementario Figura 3A): seleccione la imagen en la barra de menú y haga clic en Color | Dividir canales. Los distintos canales se mostrarán como imágenes separadas (suplementario figura 3B).
    2. Unir otra vez los tres canales en una sola imagen (suplementario Figura 4A): seleccione la imagen en la barra de menú y seleccione Color | Combinar canales. Seleccionar los canales adecuados y pulse OK (suplementario Figura 4B). Una nueva imagen de apilado no será generado (suplementario figura 4).
    3. Sincronizar las dos ventanas mediante la herramienta de Windows sincronizar (suplementario figura 5A): seleccione Analyze en la barra de menú | Herramientas | Sincronizar Windows. Aparecerá una nueva ventana con las posibilidades de la imagen de sincronizar (suplementario figura 5B).
    4. Con las dos ventanas sincronizadas (solo el video si no hay ninguna imagen multicanal asociada), la misma región en ambas ventanas puede ser recortada. Dibuje la región de interés con la herramienta de selección rectangular del menú flotante de ImageJ. Seleccione imagen en la barra de menú y seleccionar cultivos (suplementario figura 6A). Las dos imágenes recortadas se muestran individualmente (suplementario Figura 6B).
    5. Desincronizar ambas ventanas (suplementario Figura 6B) pulsando el botón Todos desincronizar en el administrador de Sincronización de Windows .
  5. Si no se ha creado una máscara como en el paso 2.4, dibuje la región de interés con la herramienta de selección rectangular del menú flotante de ImageJ.
  6. Guardar el vídeo como una secuencia de imágenes en el directorio videoSeq bajo el directorio de vídeo correspondiente (suplementario Figura 7A): seleccione el archivo en la barra de menú y haga clic Guardar como | Secuencia de imágenes... cambiar el nombre de las etiquetas de la secuencia de vídeo como video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (suplementario figura 7B): en el cuadro nombre , cambie el nombre video y haga clic en Aceptar. La secuencia debe estar sola en su directorio para ser utilizado con éxito por U-track.
    Nota: Si no diseñar una máscara para el video, vaya a paso 2.8.
  7. Diseño de una máscara. Seleccione la imagen multicanal y abra el complemento de Editor de segmentación (suplementario figura 8A): seleccione Plugins en la barra de menú y seleccionar segmentación | Editor de segmentación. Agregar y cambiar el nombre de las etiquetas de la segmentación como necesario haciendo clic derecho en las etiquetas del editor de segmentación (suplementario figura 8B, C).
    1. Elija la herramienta Selección apropiada en el menú flotante de ImageJ (aquí uso freehand), seleccione una etiqueta (verde) y diseñar primero la máscara exterior (suplementario Figura 9A). Una vez diseñado, el + el botón de opción de selección de ventana compuesto y la máscara seleccionada se mostrará en el visor (suplementario Figura 9A). Repita este paso con las siguiente etiquetas (Interior, en rojo) (suplementario figura 9B).
      Nota: Después de diseñar la máscara de las etiquetas verde y el Interior, la máscara Exterior ocupará el resto de la imagen.
    2. Máscaras se cifran en la imagen como 0, 1, 2... según el orden de las etiquetas en la ventana de etiquetas RGB. Cuando todas las máscaras para diseñan las diferentes etiquetas, guardar la máscara con el mismo nombre de archivo como el video, con el nombre mask.tif (suplementario Figura 9): seleccione el archivo en la barra de menú y seleccione guarda como | TIFF....
      Nota: Las máscaras seleccionadas se emplearán en el cálculo de los coeficientes de difusión y clasificación de las trayectorias (ver paso 4.2).
  8. Compruebe que la estructura del archivo en este momento es el siguiente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Serie1/mask.tif
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Serie1/resultados
    Nota: La mask.tif es una imagen con la máscara como diseñado en pasos 2.4 y 2.7. El video*.tiff es el video ya guardado en el paso 2.6. Como el anterior, los nombres en negrita en la lista de arriba son fijos, es decir, tienen que ser llamado de esta manera ya que estos son los nombres por las secuencias de comandos. Nombres no en negrita pueden cambiar para reflejar el experimento realizado.

3. seguimiento de las partículas

  1. Seguimiento de todas las partículas en los vídeos seleccionados usando U-track.
  2. Abrir Matlab y agregar U-track directorio a la ruta con pone camino | Añadir con opción de subcarpetas en el menú. Guarde el camino para que en un futuro las ejecuciones de Matlab U-track es en el camino. Esta configuración de ruta de acceso debe hacerse sólo una vez.
  3. Cambiar el directorio de trabajo al directorio que contiene la serie a ser analizada. Invocar U-track escribiendo en la consola (suplementario Figura 10) movieSelectorGUI y pulse enter. La ventana de selección de películas será abierto (suplementario Figura 11A).
  4. Pulse en el botón de película de nuevo y aparecerá la ventana de edición de película (suplementario figura 11B).
  5. Pulse en Añadir canal a elegir el directorio con el vídeo (VideoName/Serie1/video) y rellenar los parámetros de información de la película. Establecer el directorio de salida de los resultados de U-track a los resultados (resultados de Serie1 de videoName).
    Nota: Los parámetros de información de la película pueden obtenerse desde el microscopio y las condiciones de adquisición.
  6. Pulse Configuración avanzada canal y llenar los parámetros relacionados con la adquisición. Busque los valores de los parámetros en el ejemplo (suplementario Figura 11).
  7. Pulse Guardar en la ventana de Configuración avanzada canal y Guardar en la ventana de edición de película . El programa le pedirá confirmación de la escritura el archivo llamado movieData.mat en el directorio de resultados . Confirmar.
  8. Después de crear la película, pulsa en continuar en la ventana de selección de película. U-pista preguntará sobre el tipo de objeto a analizar. Elegir solo-partículas (suplementario figura 12). La ventana de panel de Control aparecerán (suplementario Figura 13A).
    1. Seleccione el primer paso paso 1: detección de y pulsar en configuración. Aparecerá la ventana de Ajuste de mezcla modelo gaussiano ajuste (suplementario figura 13B). En el ejemplo, "Valor de alfa para la comparación con el fondo local" se establece en 0.001 y "Rolling-Window tiempo promedio" 3 (suplementario figura 13B).
    2. Pulse en Apply en la ventana de Ajuste de mezcla modelo gaussiano configuración y funcionamiento en el panel de Control. Con la configuración en la figura 13 suplementario, sólo el paso de detección funciona. Este paso toma unos pocos minutos (2-5). Compruebe los resultados presionando el botón de resultado de paso 1 (detección, suplementario figura 14).
      Nota: Como se muestra arriba, la película muestra círculos rojos en las partículas detectadas. Si no hay círculo rojo se muestra, este paso no ha funcionado correctamente.
  9. Realizar la identificación de pistas, es decir, fusión de las partículas detectadas en el paso anterior en temas que abarcan varios cuadros. Este es el paso 2: seguimiento de de U-track cuya configuración debe definirse como se muestra en la Figura complementaria 15A-C. Paso 2 costo función ajustes de fotograma a fotograma y de cierre de brecha, combinar y dividir en el ejemplo se muestran en suplementario figura 15B y C, respectivamente.
  10. Después de configurar los parámetros para el paso 2, pulse Ejecutar en el panel de Control y sólo de paso 2 carreras (suplementario Figura 16).
  11. Realizar análisis de pista, paso 3. Definir la configuración como se muestra en la figura 17 suplementario (panel derecho). A continuación, pulse aplicar en el panel de análisis de movimiento de ajuste y correr en la pista de Control Panel-U. Este paso toma unos segundos.
  12. Verificar con el botón de resultado del paso 3 que el proceso ha identificado correctamente todos los temas. Para hacerlo, haga clic en Mostrar número de pista de la ventana Opciones de película y cuadro por cuadro que cada canción ha sido correctamente identificado (suplementario Figura 18). Anotar manualmente las partículas que no son verdaderas partículas.
    Nota: Si no se hace esta selección manual, una débil selección automática se puede realizar más adelante cuando se calcula el coeficiente de difusión (ver paso 4).

4. cálculo de los coeficientes de difusión y clasificación de las trayectorias de

  1. Asegúrese de que todos los scripts son invocados desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo, VideoName/Serie1).
  2. Leer todas las trayectorias para calcular los coeficientes de difusión emitiendo en Matlab el comando de consola: trajectories=readTrajectories(0.1), donde 0.1 es el tiempo en segundos entre dos fotogramas consecutivos (intervalo de tiempo, se muestra en el panel de película Información, suplementario figura 11B).
  3. Excluyen trayectorias correspondientes a trayectorias de puntos incorrectamente identificados. Dar una lista de los lugares para excluir. Por ejemplo, para excluir los puntos 4, 5 y 28, escriba: trayectorias = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Calcular los coeficientes de difusión instantánea de cada una de las pistas de esta célula. En este caso, calcular el coeficiente de difusión para un retraso de tiempo = 4, llamado D1-4. Para hacerlo, ejecuta en la consola de Matlab el comando: D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa') donde trayectorias son la trayectoria obtenida en el paso 3, 113.88e-3 es el tamaño de píxel de las imágenes adquiridas en micrones, 0.0015 es un límite superior para los coeficientes de difusión de partículas inmóviles medidos en μm/s de2y 'alpha' es el modelo ajustado como se explica a continuación.
    Nota: Cuando se utiliza una cámara más rápida y la necesidad de más marcos para calcular el parámetro de difusión aumentan, por ejemplo a 20, por D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa', '', 20). El parámetro de cadena antes de 20, en el ejemplo anterior, '', es el sufijo añadido a los archivos de salida. Este sufijo puede utilizarse para diferenciar diferentes análisis.
  5. Ajuste el MSD con una función diferente por llamar a la función calculateDiffusion nuevo con un modo de conexión diferentes ('limitado', 'libre' o 'dirigido'). En este ejemplo, 'limitado': D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'confinado').
  6. Obtener los resultados de ajuste para el modelo dirigido, como se muestra en la figura 20 suplementarios.
  7. Descomponer las trayectorias en trayectorias cortas y largas. Utilice el comando: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) donde 50 es la longitud mínima en los marcos de una trayectoria a considerar (en el ejemplo mostrado).
  8. Estudio de trayectorias cortas, usando el mismo procedimiento de instalación descrito en el paso 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'dirigida', 'Corto'). Analizar trayectorias cortas y anómalas con el comando: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Corto').
  9. Analizar trayectorias largas para clasificar el tipo de movimiento a través de su espectro de escalamiento de momento (MSS)7. El comando: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'largo') en pantalla se muestran los análisis y genera un archivo llamado trajectoryClassification < sufijo > .txt en el directorio results\TrackingPackage\tracks.

5. cálculo de Ssize Cluster a través de la densidad de la partícula

Nota: Asegúrese de que todos los scripts son invocados desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo mostrado, VideoName/Serie1).

  1. Analizar la intensidad de cada partícula a lo largo de su trayectoria. Para ello, invocar la secuencia de comandos escribiendo en la consola de Matlab: analyzeSpotIntensities que toma como entrada las trayectorias calculadas por U-pista en la primera sección. En su forma más básica, llamada simplemente el script sin ningún argumento desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo mostrado, VideoName/Serie1) analyzeSpotIntensities(). Configurar este comportamiento básico de muchas maneras diferentes, proporcionando argumentos a la escritura como en: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, valor1, ' Arg2´, valor2,...). Argumentos válidos con sus correspondientes valores de las variables ('ArgN´, valorN) aparecen.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analizar la intensidad de la fluorescencia usando el spotRadius de 1 pixel (por defecto) que corresponde a un parche de tamaño 3 x 3 centrado en el punto ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Nota: Para un parche de 5 x 5 centrada en el lugar, elegir un spotRadius de 2, etcetera.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Si este argumento se da valor de 1 (true), analizar sólo las trayectorias que comienzan en el primer fotograma del vídeo. Esto es útil para analizar imágenes de control (por defecto 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Si este argumento se establece en 0 (falso), luego mantener la coordenada del punto en su primer fotograma para todos los marcos (esto es útil para puntos inmóviles). Si el argumento se establece en 1 (por defecto 1, true), entonces el lugar se realiza un seguimiento a lo largo de los siguientes videos calcularon las coordenadas de U-track.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Incluir el número de la trayectoria de esas trayectorias excluido en el paso 4.3 (en el ejemplo 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Si este argumento se establece en 1 (verdadero), entonces analizar la intensidad en el parche al final del video (incluso si la trayectoria se detiene antes). La coordenada del punto es la última coordenada en la trayectoria (si trackTrajectory es true) o la primera coordenada de la trayectoria (si trackTrajectory es false). Este argumento es falso (0) por defecto.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Si se establece este parámetro, entonces correcta la cruda fluorescencia medidos en cada punto la estimación de la fluorescencia de fondo para ese punto (véase abajo). Este argumento es true (1), por defecto.
    7. ('meanLength´, número de fotograma)
      Si se establece este parámetro, el punto de intensidad media se mide en la longitud indicada. Conjunto 'meanLength', 20 para medir la intensidad media de punto en los primeros 20 frames. Si no es el argumento, la intensidad de la mancha se calcula en toda la trayectoria (por defecto, longitud total).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Establezca este parámetro como 1 (por defecto 0, false), para trazar el perfil de intensidad a lo largo de los diferentes marcos, así como sus antecedentes.
      Nota: Estos diagramas son muy útiles para identificar fotoblanqueo como se muestra en la figura 21 suplementario. Para cada ruta, la rutina automáticamente analiza si es posible que haya habido fotoblanqueo. Esto se hace comparando los valores de intensidad con t de un estudiante en las primeras y la últimas N frames a lo largo de la ruta. Por defecto, N es 10, pero este valor puede modificarse a través del argumento de ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, valor)
      Establezca este parámetro para determinar el fondo de cada lugar. Esto puede hacerse de varias maneras, y que uno a utilizar puede ser seleccionado cambia el "valor":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Utilice este valor para identificar manualmente el fondo para el video entero. Permiten para seleccionar 8 puntos en el primer fotograma del vídeo. Un parche alrededor de estos puntos se analiza a lo largo del video entero, y el cuantil del 95% de estas intensidades es elegido como la intensidad de fondo para todos los puntos.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Utilice este valor para identificar manualmente el fondo de cada marco. Elegir 8 puntos por cada punto y cada fotograma. Esta es una tarea mucho tiempo pero da mucho control al usuario. El cuantil del 95% de las intensidades en estos parches es elegido como la intensidad de fondo de este lugar en este marco.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Usar este valor para calcular el fondo de cada punto estimado de 8 puntos en un círculo alrededor de la mancha con un radio controlado por el argumento ' backgroundRadius´ (por defecto, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Utilice este valor para calcular el fondo de cada marco primero localizar el celular en el video y luego analizar las intensidades de la célula en cada fotograma (suplementario figura 22).
        Nota: El fondo es elegido como el valor de gris en un cuantil dado de esta distribución (por defecto 0.5 (= 50%), aunque este parámetro puede ser controlado a través de la discusión ' backgroundPercentile´, este valor se puede establecer más alto, por ejemplo, 0,9 (= 90%) Si ganas más de la célula para ser considerado como fondo. Para ayudar en la identificación de la célula, indica que es el valor máximo del fondo esperado a lo largo de los marcos utilizando el argumento de ' maxBackground´ (por ejemplo, en todos los videos analizados, el valor de fondo normalmente no va más allá de 6000)13. De forma predeterminada, esta opción se establece en 0, lo que significa que esta ayuda no se utilice por defecto. Ver cuál es la detección de células y el área seleccionada para la estimación de fondo estableciendo el argumento ' showImages´ 1 (parada de la ejecución en cualquier momento presionando CTRL-C).
  2. Recopile la información difusión e intensidad para todas las trayectorias calculadas en los pasos 4 y 5.1, respectivamente, utilizando gatherDiffusion.AndIntensity (). Recopilar sólo la información difusión e intensidad de corta trayectoria. Para hacerlo, utiliza los sufijos utilizados en paso 4.7 y tipo: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) que ' Short´ es el sufijo utilizado en paso 4.7.
  3. Reunir el escalamiento del espectro del momento y la intensidad informationby escribiendo: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') donde 'Largo' es el sufijo utilizado en paso 4.7. Un resumen de todos los archivos generados mediante este protocolo se muestra en la figura 2.

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Resultados

El uso de este protocolo permite el seguimiento automatizado de las partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. Inicialmente, las células son transfectadas con la proteína fluorescente junto a ser rastreados. El nivel apropiado de receptores se presenta en la superficie celular que permite que SPT se obtiene por célula clasificación (figura 1). Las células son analizadas por microscopía TI...

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Discusión

El método descrito es fácil de realizar incluso sin tener experiencia previa trabajando con Matlab. Sin embargo, las rutinas de Matlab extremadamente requieren exactitud con la nomenclatura de los diferentes comandos y la localización de las diferentes carpetas empleados por el programa. En el seguimiento de rutina de análisis (paso 3), pueden modificarse varios parámetros. La ventana de "Configuración gaussiana-mezcla modelo montaje" (paso 3.8) controla cómo U-track detecta partículas individuales en el video. Esto se h...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a Carlo Manzo y Maria García Parajo por su ayuda y código fuente de los análisis de coeficiente de difusión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de ciencia, innovación y universidades (SAF 2017-82940-R) y el programa RETICS del Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 y RD16/0012/0006; RIER). LMM y JV son apoyadas por el programa COMFUTURO de la Fundación General CSIC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células Jurkat humanasATCCCRL-10915 Línea decélulas T humanas. Cualquier otro tipo de célula puede ser analizado con este software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Se pueden seguir y analizar diferentes proteínas fluorescentes con este
electroporador de células Gene Pulse X BioRad Usamos 280 V, 975 mF, para las celdas Jurkat. Utilice el método de transfección que mejor funcione en sus manos.
Citómetro de flujo Cytomics FC 500 Beckman Coulter
MoFlo Astrios Clasificador de celdas Beckman CoulterDependiendo del nivel de transfección, es posible que no sea necesaria la clasificación de células. También se pueden emplear células con expresión estable de niveles adecuados del receptor de interés.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Se utiliza para cuantificar el número de receptores en la superficie celular.
Placas de micropocillos con fondo de vidrioMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Fibronectina humana de plasmaSigma-AldrichF0895
Recombinante humano CXCL12PeproTech300928A
Invertido Leica AM TIRFLeica
EM-CCD cámaraAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABEl software MathWorks, Natick, MA
U-Track2Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
software u-Track2Herramienta Matlab.  Para la instalación, descargue .zip archivo de la página web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) y descomprima el archivo en un directorio de su elección
GraphPad PrismaSoftware
GraphPad

Referencias

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