Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.

Abstract

Rastreo en una secuencia de vídeo y el posterior análisis de sus trayectorias de partículas hoy en día es una operación común en muchos estudios biológicos. Usando el análisis del receptor de membrana de la célula de clusters como un modelo, presentamos un protocolo detallado para esta tarea de análisis de imagen con Fiji (ImageJ) y rutinas Matlab para: 1) definir regiones de interés y diseñar máscaras adaptadas a estas regiones; 2) rastrear las partículas en los videos de la microscopia de fluorescencia; 3) analizar las características de difusión y la intensidad de las pistas. El análisis cuantitativo de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y el tamaño de cluster obtenida por microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes proporciona una herramienta valiosa para determinar objetivamente la dinámica de la partícula y las consecuencias de la modificación de condiciones ambientales. En este artículo presentamos protocolos detallados para el análisis de estas características. El método descrito aquí no sólo permite la detección de una sola molécula de seguimiento, pero también automatiza la estimación de los parámetros de difusión lateral en la membrana celular, clasifica el tipo de trayectoria y permite análisis completo superando así la dificultades para cuantificar el tamaño de punto durante su trayectoria entera en la membrana celular.

Introduction

Proteínas de la membrana incrustadas en la bicapa lipídica están en continuo movimiento debido a la difusión térmica. Sus dinámicas son esenciales para regular las respuestas celular, Interacciones intermoleculares permiten la formación de complejos que varían en tamaño desde monómeros oligómeros e influir en la estabilidad de complejos de señalización. Elucidar los mecanismos que controlan la dinámica de la proteína es así un nuevo reto en la biología de la célula, necesario para entender las vías de transducción de señal y para identificar funciones imprevistas.

Se han desarrollado algunos métodos ópticos para el estudio de estas interacc....

Protocol

1. preparación de muestras biológicas

1. Cultivar células de Jurkat en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, NaPyr y L-glutamina (RPMI completo). Células de Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ células/400 μL de RPMI 1640 con 10% FCS) con un vector del receptor del chemokine etiquetados GFP monomérico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir su detección mediante microscopía de fluorescencia.
   Nota: Es posible utilizar otras monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etcetera.
2. 24 h después de la transfección analizar las células en un citómetro de flujo para determinar la viabilidad celular y la expresión de CXCR4-AcGFP.

Results

El uso de este protocolo permite el seguimiento automatizado de las partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. Inicialmente, las células son transfectadas con la proteína fluorescente junto a ser rastreados. El nivel apropiado de receptores se presenta en la superficie celular que permite que SPT se obtiene por célula clasificación (figura 1). Las células son analizadas por microscopía TI.......

Discussion

El método descrito es fácil de realizar incluso sin tener experiencia previa trabajando con Matlab. Sin embargo, las rutinas de Matlab extremadamente requieren exactitud con la nomenclatura de los diferentes comandos y la localización de las diferentes carpetas empleados por el programa. En el seguimiento de rutina de análisis (paso 3), pueden modificarse varios parámetros. La ventana de "Configuración gaussiana-mezcla modelo montaje" (paso 3.8) controla cómo U-track detecta partículas individuales en el video. Esto se h.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células Jurkat humanas	ATCC	CRL-10915 Línea de	células T humanas. Cualquier otro tipo de célula puede ser analizado con este software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Se pueden seguir y analizar diferentes proteínas fluorescentes con este
electroporador de células Gene Pulse X	BioRad		Usamos 280 V, 975 mF, para las celdas Jurkat. Utilice el método de transfección que mejor funcione en sus manos.
Citómetro de flujo Cytomics FC 500	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Clasificador de celdas	Beckman Coulter		Dependiendo del nivel de transfección, es posible que no sea necesaria la clasificación de células. También se pueden emplear células con expresión estable de niveles adecuados del receptor de interés.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Se utiliza para cuantificar el número de receptores en la superficie celular.
Placas de micropocillos con fondo de vidrio	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Fibronectina humana de plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinante humano CXCL12	PeproTech	300928A
Invertido Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD cámara	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	El software MathWorks, Natick, MA
U-Track2	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
software u-Track2			Herramienta Matlab.  Para la instalación, descargue .zip archivo de la página web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) y descomprima el archivo en un directorio de su elección
GraphPad Prisma	Software