Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas

Resumen

Aquí describimos la inmunoprecipitación Rev en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los métodos descritos pueden utilizarse para la identificación de factores nucleolares implicados en el ciclo infeccioso VIH-1 y son aplicables a otros modelos de enfermedades para la caracterización de vías poco estudiadas.

Resumen

El ciclo infeccioso VIH-1 requiere interacciones virales con proteínas con factores de huésped para facilitar la replicación viral, el empaquetado y la liberación. El ciclo infeccioso requiere además la formación de complejos proteicos virales/huésped con ARN VIH-1 para regular el empalme y permitir el transporte nucleocitolasmático. La proteína HIV-1 Rev logra la exportación nuclear de ARNM VIH-1 a través de la multimerización con objetivos de acción cisintrónicos - el elemento de respuesta Rev (RRE). Existe una señal de localización nucleolar (NoLS) dentro del coOH-terminus del motivo rico en arginina Rev (ARM), permitiendo la acumulación de complejos Rev/RRE en el nucleolus. Se especula con factores nucleolares para apoyar el ciclo infeccioso del VIH-1 a través de varias otras funciones, además de mediar la exportación nuclear independiente del ARNm y el empalme. Describimos un método de inmunoprecipitación de Rev de tipo salvaje (WT) en comparación con las mutaciones nucleolares Rev (deleción y mutaciones Rev-NoLS de un solo punto) en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los factores nucleolares implicados en el transporte nucleocitotoplasm (nucleophosmin B23 y nucleolin C23), así como los factores de empalme celular, pierden la interacción con Rev en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Se identifican otros factores nucleolares, como el esnoRNA C/D 58, para perder la interacción con las mutaciones de Rev, pero su función en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías poco estudiadas.

Introducción

El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1_HXB2,....

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Mantener HLfB en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato sódico dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido. Mantener los cultivos celulares a 37oC en una incubadora humidificada suministrada con 5% de CO2. Paso de células confluentes a una densidad celular de 1 x 10⁶ celdas/ml.
2. Deseche los medios de cultivo celular. Enjuague suavemente las células con 10 ml de 1 solución salina con fosfato (PBS). Retire y deseche el 1x PBS sin interrumpir la capa de celda.
3. Agregue 2 mL de 1x solución tr....

Resultados

Las mutaciones de arginina de un solo punto y de punto múltiple Rev-NoLS, correspondientes a una variedad de patrones de localización subcelular, se examinaron en su capacidad de interactuar con los factores de host celular en comparación con WT Rev. WT Rev-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total y se teñiron con reactivo de manchas de plata. Rev-NoLS-3'flag es detectable (aproximadamente 18 kDa) en tres condiciones dife.......

Discusión

Se evaluaron análisis espectrométricos masivos que comparaban las mutaciones Rev-NoLS y WT Rev en presencia de VIH-1 para comprender los factores nucleolares involucrados en el ciclo de replicación viral. Esto identificaría los componentes nucleolares necesarios para la infectividad viral. Nucleolar B23 tiene una alta afinidad con Rev-NoLS y funciona en la localización nucleolar de Rev³ y transporte nucleocitotoplasmático de MRNAs 22 de VIH ligados a Rev. La afinidad de B23.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido acético	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrilo	Fisher Chemical	A955-500
Acrilamida:Bisacrilamida		BioRad 1610158
Bicarbonato de amonio	Fisher Chemical	A643-500
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 afinidad gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 ratón monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS película	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Colorante Reactivo Concentrado, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 ratón monoclonal IgG	Cruz Biotechnologies	sc-47725
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	B0126
Clavel leche en polvo descremada	Nestlé	N/A
Rascador de celdas	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey Columna nanoTile	Waters	186003763
Corning 100 mm Placas de cultivo tratadas con TC Fisher	Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Sustrato secante Estern	Pierce	32106
Etanol, 200 grados	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Ácido fórmico	Fisher Chemical	A117-50
GelCode reactivo de tinción azul	ThermoFisher	24590
Glicerol	Fisher Chemical	56-81-5
cabra-anti-ratón IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Yodoacetamida	ACROS Organics	122270050
KimWipe limpiador para tareas delicadas Kimberly	Clark Professional	34120
L-glutamina	Gibco
Metanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Tubo cónico de polipropileno	Falcon	352097
Escalera de proteínas preteñida, de 10 a 180	kDa Thermo Scientific	26616
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche	4693132001
BSA purificado New	England Biolabs	B9001
PVDF  membrana Western bómbolo	Roche	3010040001
Piruvato de sodio	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 solución detergente	BioRad	1610407
Trizaic fuente	Waters	N/A
tripsina-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	Espectrómetro de masas BioRad	1706531
Synapt G2	Waters	N/A Papel
filtro Whatman	Tisch Scientific	10427813

Santa 25030081 de