Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Resumen

Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.

Resumen

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.

Introducción

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos¹. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la....

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité Permanente de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard y Brigham and Women's Hospital, protocolo 2016N000230.

1. Ratones utilizados para el experimento

1. Utilice ratones machos y hembras de 8 semanas de edad sobre el fondo B6 para administrar la mezcla de anticuerpos.
2. Utilice ratones CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT para determinar si las imágenes de LN enteras ex vivo también se pueden aplicar a ratones reportero sin administrar mezcla de anticuerpos, así como para investigar la presencia de células mononucleares, incluida la presentación de antígenos células y fago....

Resultados

Este manuscrito muestra técnicas para eliminar los ganglios linfáticos inguinales y popliteales sin dañar su estructura después de la inyección de anticuerpos con etiqueta fluorescente para manchar poblaciones celulares específicas en estos órganos (Figura1 y Figura 2 ).

La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células LN con BV421 anti-CD4 y BB515 anti-CD19 y análisis de imágenes confocales definió la localización de células T .......

Discusión

La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfica

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Control de Isotipo	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 Ratón IgG2b, K Control de Isotipo	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview placa de cultivo	Greiner-Bio		627861 35x10 mm con fondo de cristal
Jeringas de insulina	BD Plastipak-Insulina		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	tamaño 21 x 20 cm / 100 hojas por caja
Pinzas curvas para microcirugía	WEP Instrumentos quirúrgicos	hechos a medida	12,5 cm
Tijeras curvas para microcirugía	WEP Instrumentos quirúrgicos	a medida
	Aguja BD PrecisionGlide-30		tiempos; ½ pulgadas
Nikon Eclipse Te + cabeza confocal A1R	Nikon	-	cargado con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rata IgG2a, κ Control de isotipo	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Microscopio confocal Zeiss LSM 710	Zeiss-cargado		con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)

de 11,5 cm calibre y