Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Summary

Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.

Abstract

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.

Introduction

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos¹. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la dinámica de las células inmunitarias presentes en el sistema linfático tendrá importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna y la inmunoterapia contra el cáncer.

La llegada de poderosos microscopios -incluyendo nuevos microscopios confocales y de superresolución- ha permitido un avance extraordinario en la comprensión de cómo se comportan las diferentes poblaciones de células inmunitarias en su entorno nativo³. Ahora es posible crear una imagen de varios subtipos celulares simultáneos utilizando unacombinación de sondas con ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de objetivos específicos 4,^5. De hecho, las técnicas de alta dimensión, incluida la citometría de masas y el análisis de flujo multiparamétrico han sido cruciales para ampliar nuestros conocimientos sobre la compartimentación y funcionalidad de diferentes células inmunitarias en la salud y la enfermedad^{6, 7}. Sin embargo, para preparar muestras para estas técnicas, los tejidos necesitan digestión y las células se separan de su entorno natural para ser analizadas en suspensiones celulares. Para superar estas limitaciones y permitir una mejor traducción en biología, el objetivo del protocolo propuesto aquí es aplicar una metodología sencilla para la imagen de ganglios linfáticos enteros ex vivo utilizando microscopios confocales con el beneficio de la mejora de la velocidad, el tejido conservación de la estructura y viabilidad celular en comparación con la tinción de inmunofluorescencia convencional. Mediante el uso de este enfoque, pudimos demostrar que los ratones deficientes para las células T,un subtipo de linfocitos T involucrados en la defensa temprana del huésped contra patógenos 4, han comprometido folículos y zonas de células T en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos nos permitieron realizar un estudio en el que demostramos que las células T desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de los órganos linfoides y la respuesta inmune humoral⁴. Además, este protocolo proporciona una vía fisiológica para que las sondas y los anticuerpos lleguen al ganglio linfático, ya que se administran por vía subcutánea y se disipan a través de la circulación linfática tisular, basándose en informes anteriores que se utilizan en el etiquetado in situ con anticuerpos para visualizar estructuras asociadas a linfáticos^8,9, dinámica central germinal^10,11,12, y objetivos fácilmente accesibles para el flujo sanguíneo^{13 ,14,15}.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el Comité Permanente de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard y Brigham and Women's Hospital, protocolo 2016N000230.

1. Ratones utilizados para el experimento

1. Utilice ratones machos y hembras de 8 semanas de edad sobre el fondo B6 para administrar la mezcla de anticuerpos.
2. Utilice ratones CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT para determinar si las imágenes de LN enteras ex vivo también se pueden aplicar a ratones reportero sin administrar mezcla de anticuerpos, así como para investigar la presencia de células mononucleares, incluida la presentación de antígenos células y fagocitos, y su distribución en el LN.
   NOTA: Los ratones reportero CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT tienen proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP) insertadas bajo el control de los promotores CX3CR1 y CCR2, respectivamente. Los ratones Reportero se pueden utilizar con o sin la inyección de la mezcla de anticuerpos. Consulte la referencia⁴ para la inyección de mezcla de anticuerpos en un ratón de reportero. Proceda a la cirugía si no se inyectará ningún anticuerpo.

2. Preparación e inyección de mezcla de anticuerpos

NOTA: Realice estos pasos en ratones descritos en el paso 1.1.

1. Diluir 1:10 de violeta brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/ml), 1:10 de azul brillante (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) y 1:20 de fiesteesterina (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) en PBS con el volumen final adecuado para inyectar en el muslo interno (a imagen inguinal) o en la pata (a la imagen popliteal) linfa.
   NOTA: Uso como isotipos: BV421 Ratón IgG2b, k Control de isotipo (R35-38; 0,2 mg/mL); PE Rat IgG2a, Control de Isotipo (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rata IgG2a, Control de Isotipos (R35-95; 0,2 mg/ml). Si cambia el anticuerpo de tinción, utilice el isotipo correcto.
2. Para la imagen de LN inguinal, inyecte 100 ml de la mezcla de anticuerpos por vía subcutánea en el muslo interno (Figura1A). Alternativamente, inyectar por vía subcutánea de 50 l de mezcla de anticuerpos en la almohadilla de la pata para crear una imagen de LN popal (Figura2A). Utilice delicadas jeringas de insulina de 1 ml (Insulina U-100) con la aguja de 0,30 mm a 13 mm (30 de calibre a 1 x 2 pulgadas).
   NOTA: Asegúrese de que la inyección para la tinción LN inguinal es subcutánea y no intramuscular (es decir), la mezcla de anticuerpos no se drenará correctamente si se realiza la administración de i.m.
3. No anestesiar a los animales antes de la inyección de mezcla de anticuerpos.
4. Espere un mínimo de 3 h (dLN inguinal) y 12 h (dLN popliteal) después de la inyección para extraer los órganos.
5. Si el etiquetado de células LN no se observa completamente utilizando grandes tintes fluorescentes de polímero como violeta brillante o azul brillante, utilice fluoróforos más pequeños, incluyendo isotiocianato de fluoresceína (FITC), PE y aloficocyanina (APC) como alternativa.

3. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático drenante inguinal

1. Ratones euthanizales utilizando asfixia por_CO2 seguida de luxación cervical.
2. Inmovilizar ratones en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la piel abdominal para evitar la deposición de piel alrededor de la incisión (Figura1B). La eliminación de la piel no es necesaria.
3. Realizar una incisión de línea media utilizando tijeras curvas de microcirugía (11,5 cm) y fórceps curvos de microcirugía (12,5 cm) en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide (Figura1C).
4. Disociar la musculatura abdominal de la piel (Figura 1D).
5. Realice incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical para crear colgajos de piel en el lado de interés (según el lado de la inyección de mezcla de anticuerpos) y agitar la piel para visualizar el ganglio linfático (Figura1E).
6. Tape el cierre de la piel en la placa de acrílico (Figura1F).
7. Retire el ganglio linfático drenante inguinal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1F). El ganglio linfático aparecerá como una esfera translúcida, generalmente bilobular, debajo de la piel.

4. Procedimiento de cirugía para extirpar el ganglio linfático de drenaje popliteal

1. Ratones euthanizales utilizando asfixia por_CO2 seguida de luxación cervical.
2. Inmovilizar ratones en una posición propensa en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral con un hisopo de algodón en la pantorrilla y la rodilla (Figura2A-D).
3. Realice una incisión de línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla (Figura2E,F).
4. Disociar la musculatura de la pantorrilla de la piel (Figura2F,G).
5. Exponer la fosa popliteal (Figura2G). El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida en la fosa popliteal.
6. Retire el ganglio linfático popliteal utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura2G).
7. Alternativamente, gire el ratón sobre la posición supina, y acérquese a la fosa popliteal entre el bíceps femoris y semitendinosus para la extirpación del LN popliteal realizando una incisión de línea media en el talón desde el talón hasta la rodilla seguida de la disociación de la pantorrilla musculatura de la piel.
   NOTA: La fosa popliteal es una depresión poco profunda situada en la parte posterior de la articulación de la rodilla. Abra cuidadosamente para ver el ganglio linfático popliteal.

5. Preparación de los ganglios linfáticos

1. Coloque todo el órgano en un recipiente de cultivo con fondo de vidrio (35 mm x 10 mm) y retire la grasa que rodea el órgano utilizando fórceps curvos de microcirugía (Figura1G-I y Figura 2H).
2. Centralice el órgano en el centro del plato (Figura1J y Figura 2H).
3. Cubra el órgano con un fragmento de delicados limpiaparabrisas de tareas y manténgalo empapado con solución salina a temperatura ambiente 0,9% o solución de tampón de fosfato (Figura1K-M y Figura 2H).
   NOTA: No es necesario lavar los ganglios linfáticos después de la extracción o realizar la extracción de los ganglios linfáticos en la campana.

6. Microscopía confocal ex-vivo (Imágenes)

1. Coloque la placa Petri en la ranura del microscopio confocal invertido (Figura1N y Figura 2H).
2. LNdes de imagen bajo un microscopio confocal (Figura1O y Figura 2H).
3. En primer lugar, obtener el enfoque correcto utilizando la luz convencional del microscopio confocal con objetivo 4x o 10x. A continuación, cambie de la función de luz al modo láser.
   NOTA: Si el microscopio confocal no contiene un objetivo 4x, el enfoque se puede obtener perfectamente utilizando el objetivo 10x.
4. Ajustar la potencia del láser, el desplazamiento y la ganancia utilizando una muestra de isotipo manchada, no manchada o no fluorescente (Tabla 1) para eliminar la autofluorescencia y las manchas inespecíficas de anticuerpos con etiqueta fluorescente como los utilizados en las imágenes mostradas en este manuscrito (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 y PE anti-F4/80).
5. Ajuste las posiciones Z y XY, utilizando el micrométrico y el carro, respectivamente, en el área de interés en el ganglio linfático.
6. Adquirir imágenes bajo objetivos 4x, 10x y 20x centrándose en la estructura LN y la distribución celular. Utilice la definición de 1024 x 1024 píxeles.
   NOTA: Adquirir un mínimo de cinco imágenes en diferentes campos por objetivo por animal.
7. Analice imágenes utilizando un software de imagen para separar canales, añadir escala y colores de interés, y reconstruir la vista 3D.

Results

Este manuscrito muestra técnicas para eliminar los ganglios linfáticos inguinales y popliteales sin dañar su estructura después de la inyección de anticuerpos con etiqueta fluorescente para manchar poblaciones celulares específicas en estos órganos (Figura1 y Figura 2 ).

La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células LN con BV421 anti-CD4 y BB515 anti-CD19 y análisis de imágenes confocales definió la localización de células T ...

Discussion

La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfica

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Control de Isotipo	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 Ratón IgG2b, K Control de Isotipo	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview placa de cultivo	Greiner-Bio		627861 35x10 mm con fondo de cristal
Jeringas de insulina	BD Plastipak-Insulina		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	tamaño 21 x 20 cm / 100 hojas por caja
Pinzas curvas para microcirugía	WEP Instrumentos quirúrgicos	hechos a medida	12,5 cm
Tijeras curvas para microcirugía	WEP Instrumentos quirúrgicos	a medida
	Aguja BD PrecisionGlide-30		tiempos; ½ pulgadas
Nikon Eclipse Te + cabeza confocal A1R	Nikon	-	cargado con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rata IgG2a, κ Control de isotipo	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Microscopio confocal Zeiss LSM 710	Zeiss-cargado		con 4 líneas láser principales (405, 488, 543 y 647 nm)