Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Summary

Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.

Abstract

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular proliferativa específica del paciente que puede diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. Los progenitores endoteliales bipotentes (EP), que pueden diferenciarse en los tipos celulares necesarios para ensamblar la vasculatura funcional madura, se han derivado de células madre embrionarias e pluripotentes inducidas. Sin embargo, estas células no han sido rigurosamente evaluadas en entornos tridimensionales, y una medida cuantitativa de su potencial vasculogénico sigue siendo esquiva. Aquí, la generación y el aislamiento de iPSC-EPs a través de la clasificación de células activadas por fluorescentes se describen primero, seguido de una descripción de la encapsulación y el cultivo de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno. Este microambiente de imitación de matriz extracelular (ECM) fomenta una respuesta vasculogénica robusta; redes vasculares se forman después de una semana de cultivo. Se delinea la creación de una canalización computacional que utiliza software de código abierto para cuantificar esta respuesta vasculogénica. Esta canalización está diseñada específicamente para preservar la arquitectura 3D del plexo capilar para identificar de forma robusta el número de ramas, los puntos de bifurcación y la longitud total de la red con una mínima entrada del usuario.

Introduction

Las células endoteliales de las venas umbilicales humanas (HUVEC) y otros tipos de células endoteliales primarias se han utilizado durante dos décadas para modelar la brotación de vasos sanguíneos y el desarrollo in vitro¹. Estas plataformas vasculares prometen iluminar los mecanismos moleculares y a nivel tisular de las enfermedades cardiovasculares y pueden presentar información fisiológica sobre el desarrollo de las redes vasculares primitivas^2,3. Aunque el campo del modelado vascular ha sido testigo de avances significativos, un ensayo de "estándar de oro" que puede modelar cuantita....

Protocol

1. Preparación de medios de cultivo y soluciones de recubrimiento

1. Para preparar la solución de recubrimiento vitronectina, diluir vitronectina 1:100 en la solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco.
   ADVERTENCIA: Una vez diluido, no se recomienda almacenar esta solución para su uso futuro.
2. Al recibir la mezcla de proteína gelatinosa reducida en el factor de crecimiento (ver Tabla de Materiales)del fabricante, descondece sobre hielo a 4oC hasta que la mezcla sea transparente y fluida. Manteniendo la mezcla sobre hielo en una campana de flujo laminar, pipeta 75 s de la mezcla en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml y c....

Results

Despuésde la diferenciación (Figura 1), FACS y encapsulación de iPSC-EPs en hidrogeles de colágeno, las células normalmente permanecerán redondeadas durante 24 horas antes de comenzar a migrar y formar lúmenes iniciales. Después de unos 6 días de cultivo, un plexo capilar primitivo será visible en el hidrogel cuando se vea con microscopía de campo brillante (Figura2). Después de tomar imágenes de los hidrogeles fijos, de células .......

Discussion

Este protocolo implica el cultivo a largo plazo de células en tres tipos de medios de cultivo celular: E8, LaSR Basal y EGM-2. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para esterilizar adecuadamente todos los materiales. Además, las batas de laboratorio y los guantes limpiados con etanol siempre deben usarse cuando se trabaja en la campana de flujo laminar del laboratorio. Se recomienda realizar pruebas frecuentes de contaminación por micoplasma; si se observa una gran cantidad de escombros durante el cultivo de iPSC o .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Una placa plana de cultivo de tejidos con fondo de vidrio y paredes laterales permite la obtención de imágenes confocales sencillas
Microplaca de 96 pocillos, fondo redondo, fijación ultra baja, estéril	Corning	7007	Evita la unión de hidrogeles de colágeno cargados de células a la placa de cultivo celular
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Solución suave de desprendimiento de células; no degrada los epítopos extracelulares vitales para FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	El medio base para la diferenciación de iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific		50136165 Sistema de purificación de agua; otros pueden ser fácilmente sustituidos
Solución de albúmina sérica bovina, 7,5% en DPBS, filtrada estéril, BioXtra, adecuada para el cultivo celular	Fisher Scientific	A8412	Para preservar la viabilidad celular cuando los FAC clasifican
CD34-PE, humano (clon: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Anticuerpo utilizado para el aislamiento de FACs de iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induce la formación de mesodermo a partir de células madre pluripotentes
Colágeno I Cola de Rata Alta Proteína 100 mg	VWR	354249	Componente principal del microambiente 3D
Tubos de centrífuga cónicos (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Se utiliza para almacenar y mezclar volúmenes relativamente grandes de reactivos y medios
de cultivo celularDAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Para contratinción y visualización de núcleos celulares
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Para la dilución de Matrigel y la descongelación de células madre pluripotentes
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Para lavar cultivos monocapa
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Para el paso de colonias de células madre pluripotentes y para prevenir la agregación celular cuando se clasifican las FAC
Medio de crecimiento de células endoteliales 2	PromoCell	C-22011	Promueve la viabilidad y proliferación de las células endoteliales
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Para el mantenimiento de las células madre pluripotentes
Glicina,BioUltra, para biología molecular, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutraliza el detergente restante
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidrato,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Componente del medio de diferenciación iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Entorno de computación numérica multiparadigma (disponible de forma gratuita en la mayoría de las instituciones académicas)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Ratón 10 mL (mezcla de proteínas gelatinosas)	Fisher Scientific	356231	Diluido en DMEM/F12 para recubrir placas para la diferenciación de iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific		1825015 Se utiliza para equilibrar la osmolaridad final del hidrogel y
el pH Tubos de microcentrífuga (1,7 mL)	VWR	87003-294	Almacena pequeños volúmenes de reactivos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	El ingrediente principal de las soluciones de inmunotinción
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific		15140122 Antibiótico utilizado después de la clasificación para eliminar la posible contaminación del instrumento FACS
Recombinante Human VEGF 165 Protein	R& D Systems	293-VE	Mitógeno que estimula la proliferación de células endoteliales y la tubulogénesis
Rodamina faloidina	Themo Fisher Scientific	R415	Para identificar la deposición de F-actina y, por lo tanto, delinear los límites de las redes vasculares
Triton X-100 (tensioactivo no iónico)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergente utilizado para permeabilizar suavemente las células
Tween-20 (reactivo emulsionante)	Fisher Scientific	BP337	Aumenta la especificidad de unión de los anticuerpos añadidos
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Identificar la luz endotelial 3D en hidrogeles de colágeno
Vitronectina	ThermoFisher	A14700	Para el mantenimiento de células madre pluripotentes
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserva la viabilidad de las células madre pluripotentes y de iPSC-EP cuando se disocian y se vuelven a sembrar