Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

Josiah Fernandez; Enrique C Torchia

doi:10.3791/59353

Artículo de método

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

DOI:

10.3791/59353

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9 de mayo de 2019

Josiah Fernandez¹ , Enrique C Torchia¹

¹Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe cómo aislar los queratinocitos de la piel de los modelos de ratón, para manchar con anticuerpos etiquetados con metal, y analizar las células manchadas por citometría de masa para perfilar el patrón de expresión de proteínas de interés en las diferentes fases del ciclo celular.

Resumen

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El objetivo de este protocolo es detectar y cuantificar los cambios en la expresión de proteínas de una manera dependiente del ciclo celular utilizando células individuales aisladas de la epidermis de la piel del ratón. Hay siete pasos importantes: separación de la epidermis de la dermis, digestión de la epidermis, tinción de las poblaciones de células epidérmicas con cisplatino, código de barras de muestra, tinción con anticuerpos metálicos etiquetados para marcadores de ciclo celular y proteínas de interés, la detección de anticuerpos marcados con metal por citometría de masas y el análisis de la expresión en las distintas fases del ciclo celular. La ventaja de este enfoque sobre los métodos histológicos es el potencial de probar el patrón de expresión de >40 marcadores diferentes en una sola celda en diferentes fases del ciclo celular. Este enfoque también permite el análisis de correlación multivariante de la expresión de proteínas que es más cuantificable que los métodos histológicos/imágenes. La desventaja de este protocolo es que se necesita una suspensión de células individuales, lo que resulta en la pérdida de información de ubicación proporcionada por la tinción de secciones de tejido. Este enfoque también puede requerir la inclusión de marcadores adicionales para identificar diferentes tipos de células en suspensiones de células brutas. La aplicación de este protocolo es evidente en el análisis de modelos de enfermedades hiperplásticas de la piel. Además, este protocolo se puede adaptar para el análisis de un subtipo específico de células (por ejemplo, células madre) mediante la adición de anticuerpos específicos de linaje. Este protocolo también se puede adaptar para el análisis de células de la piel en otras especies experimentales.

Introducción

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La correlación de la expresión génica con las etapas del ciclo celular sigue siendo un desafío en el análisis de modelos animales de enfermedades hiperplásicas como el cáncer. Parte de este desafío es la co-detección de proteínas de interés (PDI) con marcadores de proliferación. Células proliferativas se pueden encontrar en varias fases del ciclo celular incluyendo G1, S, G2, y M. Ki67 es uno de los marcadores más utilizados de proliferación y se expresa en todas las fases del ciclo celular. Ha sido ampliamente utilizado en el análisisde tejidos humanos y ratón 1,²^,³. Sin emb....

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Protocolo

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El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus aprobó los experimentos con animales descritos en este protocolo.

1. Preparativos

Diseñe un panel de anticuerpos con etiqueta metálica. Utilice el software gratuito de diseño de paneles en línea¹² e incluya ¹²⁷IododeoxyUridine (IdU), ¹⁶⁴Dy (Dysprosium) con la etiqueta anti-CCNB1 (CYCLIN B1), ¹⁷⁵Lu (Lutetium) fosfo (p)-HISTONEH3^Ser28 (pHH3) y ¹⁵⁰ Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteína^Ser807/811 (pRB)¹³. Añadir ant....

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Resultados

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La Tabla 1 muestra los rendimientos celulares esperados y la viabilidad del oído adulto del ratón (Figura1)y la piel neonatal en condiciones no patológicas. La tabla también muestra datos representativos de animales de un fondo mixto C57/126. Se espera que la piel de otras cepas resultaría en rendimientos celulares similares y vihabilidades. El rendimiento aproximado depende de la superficie de la piel e indica que la piel neonatal sería una .......

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Discusión

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El protocolo descrito en este documento puede completarse en aproximadamente 8 h. El resultado final es una suspensión de células enriquecidas en KCs que se pueden analizar para la expresión de proteínas de una manera dependiente del ciclo celular. Varios estudios previos han esbozado métodos para aislar los KCs de la piel humana y del ratón¹⁶^,²⁵. Estos estudios también incluyen protocolos para el aislamiento de los KCs para la citometría de flujo

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El apoyo a este trabajo provino del Departamento de Dermatología, el Centro Gates de Medicina Regenerativa de la Universidad de Colorado y el Centro de Enfermedades de la Piel de la Universidad de Colorado (UC) Morfología y Fenotipado (NIAMS P30 AR057212). Los autores reconocen la subvención UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and support (NCI P30 CA046934) para el funcionamiento del citómetro de masas y agradecen a Karen Helm y Christine Childs en el centro por su asesoramiento experto sobre flujo y citometría masiva Técnicas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 12 pocillos	Cell Treat	229512
Solución intercaladora	Fluidigm	201192A	125 µ M - Solución intercaladora
IR Paraformaldehído	Ciencias de Microscopía Electrónica	30525-89-4	16 % PFA
Tubos de flujo de tapón de filtro	Fisher/Corning	352235	35 y micro; m tamaño de poro
Tamiz celular	Fisher	22363547	40 μ m tamaño de poro
Solución de separación de células	CELLnTEC	CnT-ACCUTASE-100	Accutase
Solución de yodo	ThermoFisher/Purdue	67618-151-17	Betadine 7,5% yodo exfoliante quirúrgico
Tampón de permeabilización de código de barras	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex Pd Kit de códigos
barras	Fluidigm	201060	Cell-ID 20-Plex Pd
Kit de códigos de barras Tiras de pH	EMD	9590	colorpHast
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Dulbecco' s Pinzas Eagle Media Fine modificadas
	Dumont & Fils	0109-5-PO	Dumostar #5
Pinza de precisión curvada	Dumont & Fils	0109-7-PO	Dumostar #7
Perlas de calibración	Fluidigm	201078	EQ Perlas de calibración de cuatro elementos
HBSS	Gibco	14175-095	Hank's Solución salina equilibrada
Water	Fisher	SH30538.03	Hyclone Biología molecular grado agua
Yododesoxiuridina	Sigma	I7125	IdU
Viales criogénicos	ThermoFisher	366656PK	interna
Tampón de tinción celular	Fluidigm	201068	Maxpar Tampón de tinción celular
Fix & Tampón permanente	Fluidigm	201067	Maxpar Fix & Tampón permanente
Tampón Fix I Tampón	Fluidigm	201065	Tampón Maxpar Fix I
Salina tamponada con fosfato	Rockland	MB-008	PBS 10x sin metales
	ThermoFisher	5100-0001	Mr.Frosty
Hidróxido de sodio	Fisher	BP359-500	NaOH
Placa de Petri	Kord-Valmark	2900	Suministrado por Genesee 32-107
15 mL cónico	Olympus/Genesee	28-101
50 mL cónico	Olympus/Genesee	28-106
Placa de 6 pocillos	Cell Treat	229506
Cisplatino	Sigma 479306
Dispasa II	Sigma/Roche	4942078001
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
Ácido clorhídrico	Fisher	A144-212
Antígeno nuclear Tampón de permeabilización	Fluidigm	201063
tampón de tinción de antígeno nuclear	Fluidigm	201063
Azul de tripano	Sigma	T8154
Jeringa de tuberculina	BD	309626
Colagenasa tipo IV	Worthington Bioscience	CLSS-4

de rosca Contenedor de congelación de isopropanol

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A.

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An lisis del ciclo celular aislamiento epid rmico tinci n con cisplatino citometr a de flujo preparaci n celular panel de anticuerpos an lisis de datos

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