Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Summary

Aquí, presentamos un protocolo cultura humana enteroide o monocapas de colonoid que tienen la función de la barrera intacta para estudiar las interacciones epiteliales microbiota de host a nivel celular y bioquímico.

Abstract

3 dimensiones (3D) enteroide o colonoid culturas humanas derivadas de células base de la cripta son actualmente el más avanzado modelo ex vivo del epitelio intestinal. Debido a sus estructuras cerradas y matriz extracelular apoyo significativo, culturas 3D no son ideales para estudios de huésped-patógeno. Enteroids o colonoids puede ser cultivado como monocapas epiteliales en cultivo de tejidos permeables las membranas para permitir la manipulación de ambos luminal y basolateral de la célula superficies y fluidos acompañamiento. Esta mayor accesibilidad superficie luminal facilita modelar interacciones epiteliales bacteriana-host como la capacidad de degradar moco de enterohemorrágica e. coli (EHEC) en el epitelio colónico. Se describe un método para la fragmentación de la cultura 3D, monocapa siembra y mediciones de resistencia eléctrica (TER) de transepithelial para monitorear el progreso hacia la confluencia y la diferenciación. Diferenciación de monocapa de Colonoid produce moco secretado que puede ser estudiada por las técnicas de inmunofluorescencia o immunoblotting. Más generalmente, monocapas enteroide o colonoid permiten una plataforma fisiológicamente relevante evaluar las poblaciones celulares específicas que pueden ser objetivo de microbiota comensal o patógeno.

Introduction

Colonoids, enteroids y organitas intestinal han llevado a muchos avances en la comprensión de comportamiento de la célula de vástago, el desarrollo intestinal, función de barrera y transporte y diferenciación celular. ¹ sin embargo, cultura 3D limita el estudio de la interacción patógeno epitelial de host porque la luz no es directamente accesible a las bacterias o factores de virulencia a menos que las estructuras cerradas se someten a la microinyección. ^{2 , 3} además, secretan materiales como pequeñas moléculas, proteínas, o moco no puede probarse fácilmente de cultura 3D para el análisis posterior. El impacto de agentes patógenos en la barrera epitelial función⁴ y ion transporte⁵ ha sido evaluado en cultura 3D usando colorantes fluorescentes y microscopía de Time-lapse, pero crecidas en soportes de cultivo de tejidos permeables las monocapas son susceptibles de técnicas adicionales como medición de TER y usar cámara/voltaje abrazadera de grabación. ^{6 , 7}

Numerosas publicaciones han descrito protocolos de cultura 2D o monocapa de enteroids/colonoids. Materiales para promover la fijación de la célula epitelial incluyen hidrogeles de colágeno,^8,9 0.1% gelatina,¹⁰ matriz de capa fina membrana del sótano derivados del sarcoma murino (BMM),^{11,12, 13} y el colágeno humano IV. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17} métodos de siembra incluyen fragmentación mecánica mediante pipeteo^6,14,15 o disociación de factores de adherencia celular mediante tripsina,^10,11 dispase,¹³ o EDTA. ⁹ algunos protocolos utilizan recipientes de plástico no poroso de cultivo de tejidos para la siembra, pero esto restringe el acceso de basolateral, por lo que mayoría de las aplicaciones depende de insertos de cultivo de tejidos permeables. Documentación de mantenimiento y formación de la monocapa confluente estable varía ampliamente entre las publicaciones. Además, composiciones de medios de crecimiento y la diferenciación de las culturas humanas difieren entre los diferentes grupos y seguirán evolucionando como más investigadores adoptan y ajustan la metodología para su aplicación y a los recursos disponibles.

Para hacer frente a las limitaciones de la cultura epitelial intestinal 3D en estudios de interacción huésped-patógeno, presentamos un protocolo modificado para convertir enteroids humano 3D o colonoids a una monocapa. Después de alcanzar la confluencia en un estado inmaduro de la cripta-como, retirada de los factores de crecimiento WNT3A, RSPO1 y los inhibidores de la A-83-01 y SB 202190 conduce a la diferenciación de pequeñas vellosidades intestinales o epitelio superficial del colon. Describimos la matriz ideal, humano colágeno tipo IV, para cubrir los insertos y obtener fragmentos enteroide o colonoid uniforme para la galjanoplastia. Demostramos que este protocolo produce una monocapa confluente con una alta Colonoid ter monocapas secretan una capa de mucosidad espesa apical, permitiendo estudios ex vivo de la interacción patógeno-moco mediante immunoblotting o immunostaining. También se describe un procedimiento de fijación modificado para preservar la capa de moco colónico de inmunotinción. Este método tiene como objetivo proporcionar un modelo manejable para estudiar lo primeros intestinal huésped-patógeno en infección.

Protocol

Este protocolo se basa en estudios previamente publicados por los autores. ^{6 , 7 , 14 , 15 , 16} los pasos siguientes deben realizarse en un gabinete de bioseguridad estéril utilizando técnicas asépticas adecuadas. Todos los métodos que implican a muestras humanas han sido aprobados por el institucional de Junta de Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).

1. capa de la célula cultura insertos con matriz extracelular

1. Preparar 5 mL de solución stock colágeno IV (1 mg/mL) en 100 mM de ácido acético. Dejar reposar a 4 ° C aproximadamente 4 h a hidrato/disolver completamente.
2. Alícuota del colágeno IV solución de stock y almacenar a 4 ° C (inferior a 1 mes) o a-20 ° C (> 1 mes).
3. Inmediatamente antes de la capa, diluya la solución stock de colágeno IV en agua de calidad de cultivo de tejido estéril a una concentración final de 34 μg/mL. Para la placa de 24 pocillos insertos para cultivo celular, capa cada uno Inserte con 100 μL de solución, que corresponde a 10 μg/cm².
4. Incube la placa en un estándar CO₂ cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C durante ≥ 2 h, o para mayor comodidad, sellar los bordes de la placa con la película de parafina e incubar a 4 ° C durante la noche o hasta 1 semana.

2. aislar enteroids/colonoids de cultura 3D

Nota: Enteroids o colonoids son elaboradas de las biopsias del donante y mantenidas en 3D cultura según protocolos estándar descrito anteriormente. ^{14 , 18} brevemente, las criptas se cosechan de biopsias intestinales o resecciones por quelación y agitación mecánica. Las criptas son lavadas, cosechadas y plateadas en el BMM. Expansión media (descrito en el paso 4.2) es agregado a la cultura y reemplazado cada 2 días. Formación de cultura 3D es visible dentro de horas después de la galjanoplastia.

1. Aspirar el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos y reemplazar con 1 mL de solución de cosecha fría (véase Tabla de materiales) por pozo.
2. Use un raspador celular mini para desalojar y romper la pelotilla de matriz de la membrana del sótano, prestando especial atención a cualquier material cerca de los bordes bien.
3. Agitar la placa en un agitador orbital a aproximadamente 200 rpm, 4 ° C durante 30-45 minutos.

3. disociar 3D enteroids/colonoids

1. Utilice una pipeta monocanal de P200 o una pipeta de varios canales con puntas de filtro estériles para triturate la suspensión de células.
2. Piscina de la suspension(s) de células en un frasco cónico de 15 mL. Utilizar los múltiples frascos si el volumen de suspensión total es > 6 mL.
3. Añadir un volumen igual de medio DMEM/F12 avanzado que contiene 10 mM HEPES, dipéptido L-Alanil-L-glutamina (1 x) y penicilina-estreptomicina (1 x) (lavado mediano). Invertir el tubo 3 ó 4 veces para mezclar. Centrifugar a 300 x g, 10 min, 4 ° C.
   1. Opcionalmente, aspirar el medio de lavado y reemplazar con 0,5 mL/pocillo tripsina (véase Tabla de materiales). Suspender colonoids con una pipeta de P200, cerrar el tubo y colocar en un baño de agua de 37 ° C por aproximadamente 2 minutos inmediatamente retire el tubo, añada medio lavado a un volumen final de 10 mL y repita la centrifugación como paso 3.3.
      Nota: Este paso puede ser preferible si trituración no resulta en fragmentos de tamaños uniforme.

4. la suspensión enteroide/colonoid de la galjanoplastia

1. Si insertos recubiertos se almacenaron a 4 ° C, equilibrar en una incubadora de cultivo de tejidos de₂ °C/5% CO 37 por al menos 30 min antes de la galjanoplastia de la célula.
2. Para cada inserción para platear, prepara medio cálido (entre 25 y 37 ° C) extensión de 1 mL (EM) y añade 10 μM μM 10 y Y-27632 CHIR 99021.
   Nota: EM se compone de avanzados DMEM/F12 con B27 (1 x), 50% WNT3A acondicionado medio, 15% RSPO1 acondicionado medio, 10% medio de Noggin acondicionado, EGF humano de 50 ng/mL, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiótico/antimicótico cóctel (1 x), 10 mM HEPES, Dipéptido L-Alanil-L-glutamina (1 x) y penicilina-estreptomicina (1 x) (véase Tabla de materiales).
3. Aspirar el medio de lavado del tubo que contiene el precipitado de células y resuspender en un volumen de EM suficiente para producir al menos 100 μL/insertar.
4. Aspire la solución de colágeno IV de cada inserción y lavar dos veces con 150 μL de medio de lavado por insertar.
5. Pipeta 600 μL de EM en el espacio debajo de cada inserto.
6. Pipetee 100 μL de la suspensión celular en cada inserto.
7. Devolver la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y deje reposar durante al menos 12 h.
   Nota: Evite la agitación o inclinación bruscamente la placa para evitar la distribución desigual de los fragmentos colonoid en la membrana de insertar.
8. Supervisar el accesorio de celular y separarse para formar una monocapa confluente colocando la placa en un microscopio óptico de contraste de fase bajo 2.5 x-10 x objetivo.
9. Después de 1-2 días, más fragmentos deben adherirse a la matriz de colágeno. Refrescar el medio de cultivo y descontinuar el tratamiento con Y-27632 y CHIR 99021. Seguir actualizar el medio cada 2-3 días hasta confluentes. Generalmente se llega a confluencia en 7-10 días.

5. Mida la resistencia eléctrica de transepithelial

1. Conecte los cables de los electrodos y encender el voltohmmeter epitelial (EVOM). Verificar que la función de medición se establece en ohmios.
2. Sumergir las puntas de los electrodos brevemente en etanol al 70% y secar con un pañuelo de laboratorio. Equilibrar el electrodo en 5 mL de medio de lavado por aproximadamente 5 minutos.
3. Sumerja la punta del electrodo más corta en el medio de inserción y Oriente la punta del electrodo más larga en la placa inferior bien. Mantener el electrodo en posición vertical completa hasta que la lectura de EVOM es relativamente estable, o por no más de 60 s.
   Nota: Si el conjunto de electrodos está inclinado lejos de vertical, o la altura de la punta se ajusta incorrectamente, la punta más corta puede entren en contacto con y alterar la monocapa celular.
4. Comparar mediciones de EVOM hasta el valor obtenido de una inserción sin células sumergida en medio de cultivo para evaluar los progresos hacia la confluencia o diferenciación.

6. diferenciación de las monocapas confluentes de enteroide/colonoid

1. Intercambio de EM por medio de la diferenciación (DM) y continuar actualizar los medios de comunicación cada dos días hasta el día 5. DM está EM que carece de WNT3A, RSPO1, A-83-01 y 202190 SB.
2. Continuar seguimiento TER para verificar que la diferenciación es proceder como se esperaba. TER seguirá aumentando durante los días 1-5 de la diferenciación. Las monocapas pueden continuar aumentar TER y conservar la viabilidad más allá del día 5-6 pero exhibir resultados más reproducibles y máximos cuando se utiliza al día 5-6.

7. bacteriana infección con patógenos o comensales e. coli

1. Un día antes de llevar a cabo la infección, lavado y alimentación monocapas con antibióticos EM o DM.
2. Utilizar un bucle de Microbiología estéril suavemente raspar la superficie de un stock congelado glicerol bacteriana y inocular 2 mL de caldo LB. Transferir el tubo a un estándar que sacude la incubadora a 37 ° C durante 12-16 h.
3. Diluir 50 μL de la cultura de arrancador en caldo fresco de LB de 5 mL (1: 100) y continuar la incubación con agitación durante 90 minutos. Esto producirá una cultura de la fase de registro con una densidad de 10⁵-10⁶ unidades formadoras de colonias (UFC) / mL.
   1. Opcionalmente, confirmar la concentración bacteriana por la medida de la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un espectrofotómetro.
4. Girar por el cultivo bacteriano a 12.000 x g durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender las bacterias antibióticos EM o DM a una concentración final de 10⁷ UFC/mL.
5. Añadir 10 μL de la suspensión bacteriana a la inserción (concentración final 10⁶ UFC/mL). Pipeta lentamente a la mezcla y evitar perturbar la capa de moco extracelular.
6. Devolver la placa a una incubadora de cultivo de tejidos durante la infección deseada.

8. fijación para preservar y immunostain moco

1. Elevación insertos para el cultivo de células de la placa de 24 pocillos, invertir con cuidado sobre un papel laboratorio para eliminar el medio apical y limpie el líquido externo a aferrarse a la inserción.
2. En una nueva placa de 24 pocillos, sumerja el inserto en una solución 1:3 de ácido acético glacial en etanol absoluto (solución de Clarke) por 10 min a temperatura ambiente.
3. Invierta el inserto para eliminar el fijador y rehidratar las células de 1 x PBS durante 10 minutos proceder con los protocolos estándar de la inmunotinción.
4. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar alrededor del perímetro de la membrana de la inserción. Transferir la membrana a un portaobjetos de vidrio con unas pinzas y colocar un cubreobjetos con medio de montaje.

9. preparación de lysates de la célula para immunoblotting

Nota: Realice los siguientes pasos en el hielo o en un cuarto frío.

1. Medio de aspirado y lavado el inserto una vez con PBS.
2. Añadir 150 μL lysis buffer que contiene inhibidores de la proteasa (véase tabla de materiales) el prospecto y dejar reposar 5-10 minutos contiene tampón de lisis 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% SDS, Cóctel de inhibidor de la proteasa de 1: 100.
3. Use un raspador celular mini para eliminar las células de la tuerca, luego utilice una pipeta P200 para triturate brevemente la suspensión y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga.
4. Someter a ultrasonidos la suspensión con 5 x 1 pulsos de s en el 20% de amplitud con una micropunta punta de prueba (véase Tabla de materiales).
5. Añadir tampón de carga SDS-PAGE si inmediatamente realizando electroforesis o alícuota y almacenar lisados a-20 ° C.

Results

Las culturas humanas enteroide y colonoid crecidas como estructuras 3D, entonces disociadas y fragmentadas para placas de colágeno humano IV-revestida de la célula cultura insertos. El progreso de la formación de la monocapa se controla fácilmente diariamente mediante microscopía de campo brillante, inmunofluorescencia, tinción (figura 1) y un aumento constante en la resistencia eléctrica transepitelial (TER) (figura 2), que refleja la permeabilidad de las ensambladuras apretadas a los iones y se correlaciona con la confluencia de la monocapa. TER de un inserto de 24 pocillos vacío es aproximadamente 50-100 Ω·cm²y al llegar a la confluencia aumenta a aproximadamente 400-500 Ω·cm². Todas las células epiteliales en monocapas confluentes son conectadas por junctional complejos detectados por el anillo de F-actina en el perímetro de la célula (Figura 1). Monocapas en medios de todo el factor de crecimiento representan el epitelio proliferativo de cripta-como compuesto principalmente de activamente dividir las células que incorporan el nucleósido análogo EdU (figura 2). Retirada de los factores de crecimiento WNT3A y RSPO1 promueve la diferenciación, hacia la vellosidad como culturas que carecen de células proliferantes. Monocapas diferenciadas contienen enterocitos (enteroids) o colonocytes (colonoids) y desarrollan las células epiteliales intestinales especializadas como se ha demostrado en cultivos 3D,¹⁸ incluyendo las células caliciformes y enteroendocrinas. ¹⁵ monocapas diferenciados también demostraron un aumento significativo en TER (> 1000 Ω·cm²) (figura 2), que indica madurez ensambladuras apretadas.

En fisiología humana normal, la capa epitelial intestinal separa nutrientes y el espacio luminal microbio enriquece el ambiente estéril de serosal. El epitelio regula estrechamente la diafonía entre estos dos compartimientos. Monocapas enteroide y colonoid preservar esta propiedad de compartimentalización importante como lo demuestra el análisis proteómico en tabla 1. Hay diferencias sustanciales entre la composición de la proteína en apical y basolateral acondicionado medios de monocapas enteroide diferenciados. Acceso a ambos lados de la apicales y basolateral permite colección de ambos sobrenadantes en una manera dependiente del tiempo para la medición de la secreción diferencial de otras moléculas tales como citocinas y quimiocinas. ^{15 , 17}

Las monocapas son modelos convenientes y altamente reproducibles para detectar los cambios en la expresión de la proteína mediante immunoblotting y el immunostaining. Así, los cambios en mucina 2 (MUC2) expresión por shRNA caída (KD) puede ser detectado usando ambas técnicas (figura 3). La transducción shRNA fue realizada en 3D colonoids y mantenida en los medios de selección antibiótica. Después de verificar el KD, colonoids puede mantiene culturas 3D continuamente o plateado como monocapas para fines experimentales. Por otra parte, MUC2 KD no afecta la eficacia de la formación de la monocapa en comparación con la línea de los padres colonoid de tipo salvaje. Colección de monocapas de immunoblotting es simple y similar a los protocolos descritos para las líneas de células humanas de adenocarcinoma derivado epitelial. Por lo general, aproximadamente 50 μg o más de proteínas totales pueden ser extraído de una monocapa de insertar crecido solo 0,33 cm² . Como se muestra en la figura 3, MUC2 es apenas perceptible en monocapas de colonoid (UD) peso indiferenciadas pero es altamente expresada en monocapas WT (DF) distinguidas. Muc2 está por debajo del nivel de detección en monocapas colonoid UD y DF transduced con shRNAs MUC2.

Lo importante, monocapas son un modelo adecuado para estudiar las interacciones huésped-microbianas en la superficie apical de los epitelios. Las monocapas de Colonoid forman una gruesa capa de moco MUC2-positivo unida a la diferenciación que no es fácilmente penetrada por comensal bacteria e. coli HS (figura 4), similar a lo que se ha sugerido en el colon humano normal. ¹⁹ sin embargo, enterohemorrágica e. coli (EHEC), un patógeno humano de colon, ha demostrado tener la capacidad de destruir la capa de moco adjunto MUC2 enriquecido para llegar a la superficie apical del epitelio (figura 4). ^{14 , 20} MUC2 restantes sólo está presente en las células caliciformes.

Figura 1: Establecimiento de humanas monocapas enteroide/colonoid. (A) ejemplo de colonoid fragmentos después de la disolución de BMM y trituración. (B) ejemplo de inserción inmediatamente después de la galjanoplastia colonoid fragmentos. Escala de la barra (A-B) = 200 μm. Representante de proyección de máxima intensidad (C) y (D) confocal óptica Z sección con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran que colonoid fragmentos sembrados en forma de colágeno humano revestido IV filtros múltiples islas de monocapa 2-4 días post siembra. Zonas libres de células (asterisco) son identificables por la ausencia de ambos nucleares (Hoechst 33342, azul) y la coloración de la F-actina apical (phalloidin verde) en proyección de máxima intensidad de C y D. representante (E) y (F) confocal óptica Sección con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran una monocapa confluente colonoid con superficie apical continua detectada por la F-actina immunostaining aproximadamente 1 semana post siembra. (G) alta magnificación de una proyección de intensidad máxima representante y sección de óptica confocal (H) con las correspondientes proyecciones ortogonales muestran que las células en monocapas confluentes de colonoid forma la perijunctional de la F-actina anillos (flecha blanca) y un borde en cepillo apical inmaduro (cabezas de flecha). Escala (C-H) de la barra = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: evaluación de diferenciación enteroide/colonoid monocapa. (A) incorporación de EdU (rojo) demuestra una pérdida progresiva de la proliferación durante la diferenciación de monocapa yeyunal. Mediciones de TER promedio (B) en monocapas confluentes yeyunal en medio de expansión o de diferenciación. Barras de error representan SEM. UD, Indiferenciado; DF, distinguido. Los números corresponden a días en virtud de la condición especificada; UD1 fue el primer día de confluencia, aproximadamente 1 semana después de la siembra. (C) las monocapas yeyunal UD tienen células amplias, más cortas y un borde en cepillo de menos maduros de la actinia-basado apical de monocapas de DF día 5 yeyunal. Escala (A, C) de la barra = 50 μm. Todas las monocapas fueron representados por lo menos 1 semana posterior siembra y eran confluentes antes de comenzar la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Colonoids de tipo salvaje y shRNA transduced caída (KD) colonoids las monocapas confluentes de cada forma. (A) imágenes representativas de tipo salvaje (WT) humano colonoid confluente monocapa distinguen por 5 días y (B) aumentado semejantemente monocapas derivados de culturas colonoid de MUC2 KD. Escala (A-B) de la barra = 50 μm (C) representante immunoblot de culturas colonoid transduced con revuelto shRNA o shRNA MUC2 demuestra que los cambios en la expresión de la proteína debido a KD pueden cuantificarse por el immunoblot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: monocapas enteroide/colonoid son modelos adecuados para el estudio de las interacciones luminales microbio-host. Proyección de intensidad máxima representante (A) y sección óptica ortogonal de una monocapa de colonoid muestra la gruesa capa de moco positivo MUC2 apical que no es permeable a e. coli capítulo (flecha negra) en el moco apical superficie. La monocapa fue infectada durante 6 horas con 10⁶ UFC/mL HS. (B) proyección de intensidad máxima representante de monocapa de colonoid humano apicalmente infectado con ECEH (10⁶ UFC/mL, 6 horas). Escala (A-B) de la barra = 50 μm. (C) mediciones de intensidad de MUC2 inmunofluorescencia muestran una disminución significativa de MUC2 en monocapas colonoid infectados por EHEC en comparación con controles no infectados. Barras de error representan SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proteína	Número de	Abundancia de péptido
Medios de comunicación basolateral
proteína de unión a ácidos grasos, hígada [Homo sapiens]	NP_001434.1	1299
Profilin-1 [Homo sapiens]	NP_005013.1	797
Apolipoproteína A-IV precursor [Homo sapiens]	NP_000473.2	744
precursor de ecto-ADP-ribosyltransferase 4 [Homo sapiens]	NP_066549.2	633
isoforma de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 1 [Homo sapiens]	NP_002037.2 (+ 1)	616
serotransferrin precursor [Homo sapiens]	NP_001054.1 (+ 1)	572
precursor de isoforma 3 de proteína de unión a vitamina D [Homo sapiens]	NP_001191236.1 (+ 2)	567
catalasa [Homo sapiens]	NP_001743.1	427
precursor de la isoforma 1 de agrin [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	377
precursor de la isoforma 1 de lactotransferrina [Homo sapiens]	NP_002334.2 (+ 1)	262
Los medios de comunicación apical
precursor del factor 3 de trébol [Homo sapiens]	NP_003217.3	326
precursor del factor 1 de trébol [Homo sapiens]	NP_003216.1	304
específicos de la membrana del sótano heparán sulfato proteoglicanos núcleo proteína isoforma precursor [Homo sapiens]	NP_001278789.1 (+ 3)	303
B filamin isoforma 1 [Homo sapiens]	NP_001157789.1 (+ 2)	240
precursor del factor 2 de trébol [Homo sapiens]	NP_005414.1	182
eliminado en precursor de b isoforma cerebral maligno tumores 1 proteína [Homo sapiens]	NP_015568.2 (+ 3)	169
queratina, tipo II 1 citoesqueleto [Homo sapiens]	NP_006112.3	157
miosina-9 [Homo sapiens]	NP_002464.1	150
precursor de la aminopeptidasa N [Homo sapiens]	NP_001141.2 (+ 1)	145
Agrin precursor [Homo sapiens]	NP_940978.2 (+ 1)	112

Tabla 1. Una lista parcial de péptidos identificados por espectrometría de masa de cromatografía/tándem líquido en apical y basolateral fluidos muestreados de distinguido yeyunal monocapas.

Discussion

Parámetros críticos para el éxito formación de monocapas enteroide/colonoid incluyen 1) sano, proliferando 3D culturas a partir de material; 2) cubriendo la superficie de inserción de cultura celular con colágeno humano IV antes de la siembra de monocapa; 3) fragmentación de 3D las culturas ya sea mecánicamente o enzimático, pero no al nivel de célula.

Durante el aislamiento de 3D enteroids/colonoids, la velocidad óptima de agitación puede variar dependiendo del diámetro de giro de un modelo dado de la coctelera. La intención es no sólo agitar la placa por una mezcla eficiente, pero también evitar salpicar la suspensión de células en la tapa de la placa o en pozos adyacentes. Períodos de incubación de 30 min de < pueden producir BMM residual a las células, que pueden dificultar el apego y la formación de monocapas de células uniformes cuando plateado en partes movibles. Amplia incubación (≥ 1 h) dará viabilidad celular significativamente disminuida.

Puede variar el grado de trituración necesario disociar 3D enteroids/colonoids con pistón rigidez y usuario destreza. Examen periódico de los contenidos bien de un microscopio óptico de contraste de fase se recomienda para determinar la uniformidad del fragmento durante la trituración, con el objetivo de aproximadamente 30 células por fragmento. En lugar de, o además de trituración, la suspensión puede ser digerida brevemente con tripsina para obtener pequeños fragmentos de uniforme. Digestión de la tripsina puede ser deseable si monocapas contienen una gran proporción de estructuras 3D-like entre una otra manera sola capa epitelial. Sin embargo, la disociación de las células no es deseable como esto disminuye significativamente la viabilidad celular. Un pozo de enteroids/colonoids en una gotita BMM 35 μL cultivada generalmente será suficiente para llenar 2-3 inserciones, pero este factor puede variar dependiendo del número y tamaño medio de la enteroids/colonoids.

Colonoid monocapas pueden absorber un volumen sustancial del medio apical como se diferencian. Esto puede eludirse mediante la aplicación de DM adicional a la cámara de relleno superior (150-200 μL), aunque secado parcial de la cámara alta parece no afectar la viabilidad de monocapa o función en ensayos posteriores. Después de aproximadamente 4-5 días de diferenciación, las monocapas de colonoid desarrollan moco extracelular que puede ser visible como material grueso/gelatinosa en la superficie de la célula después de la aspiración cuidadosa de DM.

Interacción de EHEC con la capa exterior mucosa, utilizamos habitualmente el período de titulación e incubación bacteriano especificado en el protocolo. Sin embargo, cepas bacterianas únicas deben ensayarse inicialmente en varias concentraciones y períodos de incubación para determinar los parámetros adecuados para el efecto deseado.

Durante la fijación de la mucosa, aspirando el medio apical probablemente se eliminará la mayor parte de la capa de moco suelto extracelular. Por lo tanto, es importante vaciar cuidadosamente el medio. Si el medio se mantiene en el inserto por tensión superficial, use la esquina de un pañuelo doblado laboratorio para romper la tensión superficial y más lejos del medio del fieltro. Después de la fijación y tinción, la capa de moco puede desalojar sin querer o aplanada mientras que montar un cubreobjetos sobre el filtro de inserción. Para conservar la altura de la mucosa, colocar el filtro en una gota de medio de montaje y coloque cuidadosamente el cubreobjetos sobre el filtro. No toque ni presione sobre el cubreobjetos como esto puede aplanar considerablemente la capa de moco.

Para formar una monocapa polarizada de las células en cultivo 3D, es necesario para reproducir la interacción entre las proteínas de matriz extracelular (ECM) y las integrinas de la membrana basolateral de células epiteliales intestinales. Laminina, colágeno IV, fibronectina y una matriz de proteoglicanos constituyen el ECM epitelial intestinal. ^{21 , 22} comparamos humana mástil-célula-derivados laminina, fibronectina, colágeno IV y BMM murino-derivadas como capas de relleno. Sólo colágeno IV apoyó la formación de estable, a largo plazo (4 semanas) monocapas confluentes de enteroide/colonoid (figuras 1-2). Pequeños parches de crecimiento similar a la monocapa se obtuvieron en cada una de las otras matrices de prueba, pero estas regiones no ha podido progresar a confluencia. El uso de colágeno humano IV como el suplente de ECM tiene un número de ventajas. BMM deriva de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), las células del sarcoma murino no son de origen humano, mientras que el colágeno humano IV está disponible en el mercado y generalmente más rentable. Además, el BMM es una mezcla compleja de proteínas con variabilidad inherente y puede contener factores de crecimiento secretados por el sarcoma que afectan la expresión génica. ²³

Las interacciones entre las células epiteliales intestinales y el ECM subyacente en restitución epitelial intestinal aún incompleto se entiende. La importancia del colágeno IV y laminina no, como un ligando de adherencia para colonocytes humano²⁴ y potenciador de la cripta intestinal células epiteliales restitución²⁵ ha sugerido usando los anticuerpos contra el colágeno IV que impedía accesorio . Β1-integrina expresadas epitelial parece ser importante para la interacción del ECM, como un anticuerpo específico para la integrina β1 bloqueados significativamente la adherencia de colonocytes al tipo colágeno de IV. ²⁴ mientras que el colágeno IV proporciona una confiable ECM para monocapa enteroide/colonoid formación en inserciones epiteliales remodelado de la MEC con el tiempo no ha sido evaluada todavía en este modelo, ni tiene la influencia de las mezclas de ECM más complejas y definidas de colágeno IV, laminina y fibronectina.

Enteroids/colonoids humanas en formato de monocapa (figuras 1-4) permiten manipulaciones y muestreo sería engorroso o imposible de lograr utilizando 3D embebido en matriz de culturas. Enteroids/colonoids 3D varían en tamaño, complejidad estructural y volumen luminal, y así microinyección de microbios o moléculas pequeñas son difíciles de cuantificar con precisión. Además, en contraste con las monocapas (tabla 1), 3D culturas impiden el acceso directo a las superficies luminales y basolateral para medir iones, nutrientes, citoquinas o factores secretados asociadas a procesos fisiológicos o fisiopatológicos . Confluencia (figuras 1-2) es una de las principales propiedades de la monocapa enteroide/colonoid necesaria establecer no sólo los gradientes fisiológicos de los nutrientes, iones y macromoléculas,¹⁶ pero también creando la barrera apropiada entre la microbiota luminal y mesenquimales inmune poblada de células serosas ambientes estériles. Estas facetas son importantes a tener en cuenta para futuros estudios que incorporan enteroide/colonoid monocapas con tipos de células mesenquimales, inmune y neuronal para construir modelos fisiológicos más complejos.

Señaló las limitaciones de la célula cultura insertar modelo descrito aquí incluyen la falta de fuerzas físicas como la tensión de esquileo líquido y estiramiento/compresión mecánica (peristalsis) y ausencia de un medio ambiente anaeróbico apical normalmente experimentado por intestinal epitelios en vivo. Estos elementos tienen el potencial para ser abordada con más sofisticadas plataformas de microphysiological,²⁶ pero también requieren de gastos adicionales, equipos y conocimientos para poner en práctica. Las culturas 3D y monocapa son también sin interacciones con o las contribuciones de microbioma intestinal, las poblaciones de células estromales y el sistema inmune a no ser que estos componentes se agregan útil.

Futuras aplicaciones de la monocapa enteroide/colonoid en colágeno IV-revestida de la célula cultura insertos pueden incluir otros estudios de interacción microbiana patógena o comensal, absorción de nutrientes o drogas, toxicidad, metabolismo, función de la barrera y funcional mejora catalizada por co-cultivo con tipos de la célula intestinal adicional. Las evaluaciones pueden realizarse no sólo dentro de los epitelios de donantes sanos, sino también de individuos con mutaciones genéticas o trastornos intestinales, siempre los fenotipos en vivo se establecen para ser preservado en ex vivo enteroide/colonoid cultura.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol	Sigma	T4661	Tris base, Componente del tampón de lisis
A-83-01	Tocris	2939	Inhibidor de ALK4/5/7
Ácido acético, glacial	Fisher Scientific	A38
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010	Componente del medio de crecimiento
Alexa Fluor 488 faloidina	Life Technologies	A12379	Sonda fluorescente para F-actina
Cóctel antibiótico/antimicótico	Invivogen	ant-pm-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Life Technologies	17504-044	Componente del medio de crecimiento
Insertos de cultivo celular	Corning	3470	Transwell, membrana PET, 0,4 μ poro m, placa de 24 pocillos
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β inhibidor
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imagen	Life Technologies	C10639
Colágeno IV, de placenta humana	Sigma	C5533
Cultrex Solución de recolección de organoides	Trevigen	3700-100-01	Despolimeriza la matriz
de la membrana basalEnterohemorrágico Escherichia coli (EHEC)	Laboratorio de Kaper, Universidad de Maryland
Voltohmímetro epitelial	de World Precision Instruments	EVOM2
Electrodo de voltohmetro epitelial	de World Precision Instruments	STX3
Escherichia coli cepa HS	Kaper, Universidad de Maryland
Etanol, absoluto	Pharmco	111000200
FluorSave medio de montaje	Millipore	345789	Para el montaje de membrana de inserción en portaobjetos de microscopio
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	Dipéptido de L-alanil-L-glutamina, línea celular de 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc	van den Brink lab, Instituto Tytgat de Investigación		Para la producción de Medio acondicionado Noggin
HEK293T/RSPO1-Fc-HA línea celular	Trevigen	3710-001-K	Para la producción de medio acondicionado Rspondin-1
HEPES, 1 M	Life Technologies	15630-080	Componente del medio de crecimiento
Heraeus Multifuge X1R Centrífuga	Thermo Fisher Scientific	75004250
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Fluorescente colorante nuclear
Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF)	R& D Systems	236-EG-01M	Componente del medio de crecimiento
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896	Componente del tampón de lisis
Microscopio óptico de cultivo celular invertido	Olympus	Caldo CKX51
LB	EMD Millipore	1.10285.0500
L-WNT3A línea celular	ATCC	CRL-2647	Para la producción de medio acondicionado Wnt3a
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	356231	Matriz de membrana basal para cultivo 3D
Mini raspador de células	United BioSystems	MCS-200
Anticuerpo MUC2, monoclonal de ratón	Abcam	ab11197	Úselo a 1:100 para inmunotinción, 1:500 para inmunotransferencia
Partículas lentivirales de shRNA MUC2	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ shRNA lentiviral, ID: 4583
Agitador orbital	Grant Instruments	PSU-10i
Penicilina-estreptomicina, 100x	Life Technologies	15140-122	Componente del medio de crecimiento
Solución salina tamponada con fosfato	Corning	21-031
Sonicador de sonda con micropunta	Branson Ultrasonics	450
Cóctel de inhibidores de proteasa para células de mamíferos	Sigma	P8340	Componente del tampón de lisis
SB 202190	Tocris	1264	p38 Inhibidor de MAPK
Cloruro de sodio	Sigma	S3014	Componente del tampón de lisis
Dexoilolato de sodio	Sigma	D6750	Componente del tampón de
lisis Dodecil sulfato de sodio	Sigma	L3771	Componente del tampón de lisis
TrypLE Express, 1x	Life Technologies	12605-010	Tripsina, para la digestión de fragmentos de enteroides/colonoides
Anticuerpo Vinculina, monoclonal de conejo	Abcam	ab129002	Uso a 1:1000 para inmunotransferencia
Agua, grado de cultivo de tejidos, filtrada estéril	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	Inhibidor de RhoA/ROCK