Ofrecimos mongooses placebo cebos de vacuna de rabia oral con ácido etil o metilio-ifenoxico como biomarcador y verificamos la aceptación de cebos utilizando una novedosa cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) método.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis de análogos de ácido iophenoxic en pequeña mangosta india (Herpestes Auropunctatus) Sera para su uso como un marcador biológico de vacunación de rabia oral
En este artículo
Resumen
Resumen
La pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es un reservorio del virus de la rabia (RABV) en Puerto Rico y comprende más del 70% de los casos de rabia animal reportados anualmente. El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se logra típicamente mediante una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). Actualmente no existe ningún programa de ORV de vida silvestre en Puerto Rico. Se han llevado a cabo investigaciones sobre vacunas orales contra la rabia y varios tipos de cebos para la mangosta sin demonios con resultados prometedores. El monitoreo del éxito del ORV se basa en la estimación de la aceptación de cebos por especies objetivo, lo que normalmente implica evaluar un cambio en los anticuerpos neutralizantes rabv (RVNA) después de la vacunación. Esta estrategia puede ser difícil de interpretar en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde RABV es enzoótico y los niveles de fondo de RVNA están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incorporado con la vacuna o la matriz de cebo puede ser útil. Ofrecemos 16 cebos orV placebo de mangostas cautivas que contienen ácido etil-iofenoxic (et-IPA) en concentraciones de 0.4% y 1% dentro del cebo y 0.14% en la matriz de cebo externo. También ofrecimos 12 cebos ORV de mangostas cautivas que contienen ácido metil-iofenoxic (me-IPA) en concentraciones de 0.035%, 0.07% y 0.14% en la matriz de cebo externo. Recogimos una muestra de suero antes de la oferta de cebo y luego semanalmente hasta ocho semanas después de la oferta. Extrajimos ácidos iofenoxicos de los sueros en acetonitrilo y cuantificamos mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas. Analizamos los sueros para et-IPA o me-IPA por cromatografía líquida-espectrometría de masas. Encontramos una capacidad de marcado adecuada durante al menos ocho y cuatro semanas para et- y me-IPA, respectivamente. Ambos derivados del IPA podrían ser adecuados para la evaluación sobre el terreno de la ingesta de cebo ORV en mangostas. Debido a la longevidad del marcador en la mangosta sera, se debe tener cuidado de no confundir los resultados mediante el uso de la misma derivada IPA durante evaluaciones consecutivas.
Introducción
El virus de la rabia (RABV) es un lyssavirus de una sola cadena de sentido negativo, y circula entre diversas especies de embalses de vida silvestre dentro de los órdenes Carnivora y Chiroptera. Múltiples especies de mangosta son reservorios de RABV, y la pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es el único reservorio en Puerto Rico y otras islas del Caribe en el hemisferio occidental1,2,3 . El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se realiza típicamente a través de una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). En los E....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Investigación de Vida Silvestre del USDA bajo el protocolo de investigación aprobado QA-2597.
NOTA: El siguiente protocolo describe el procedimiento de análisis para detectar el ácido metil-iofenoxic en suero de mangosta. Este método es la versión final de un proceso iterativo que comenzó con el análisis del ácido etil-iofenoxic en suero de mangosta. Durante la evaluación inicial del ácido etil-iofenoxic se realizaron modificaciones menores en los métodos, dando como resultado el protocolo final que se presenta a continu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En la Figura 1se presentan cromatogramas iónicos representativos de un análisis me-IPA. El suero de mangosta de control (Figura1A)ilustra el tiempo de retención de et-IPA (analito suplente) y la ausencia de me-IPA en el tiempo de retención indicado. La muestra de control de calidad (Figura1B)ilustra la separación de línea de base de me-IPA de et-IPA, así como las transiciones de cuantificador y calif.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El método LC-MS/MS desarrollado para los estudios utilizó la selectividad de la monitorización de reacciones múltiples para cuantificar con precisión me-IPA y et-IPA en suero de mangosta. La selectividad de la detección de MS/MS también permitió un protocolo de limpieza simple que dependía únicamente de acetonitrilo para precipitar proteínas del suero antes del análisis.
Los ácidos iophenoxic son solubles en ACN pero son prácticamente insolubles en agua. Para excluir el agua de la extracción d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores AV y SO son empleados a tiempo completo de un fabricante de cebos de vacunas contra la rabia oral.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada en parte por el programa de investigación intramuros del Departamento de Agricultura, Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal de los Estados Unidos, Servicios de Vida Silvestre, Programa Nacional de Gestión de la Rabia y IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemania).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acetonitrilo, grado Optima | Fisher | A996 | |
| Balanza analítica | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 columna, 2,1 x 50 mm, 2,5-µ m tamaño de partícula | Waters Corp. | ||
| Fuente ESI | Agilent | G1958-65138 | |
| Ácido etil-iofenóxico, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lote MKBP5399V |
| Ácido fórmico, grado LC/MS Software LCMS | Fisher | A117 | |
| LCMS | Agilent | MassHunter Adquisición de datos y análisis | |
| Ácido metil-ioofenóxico, 97 % (p/p) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lote PR0709514717 |
| Balanza microanalítica | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Cebos orales para la vacuna antirrábica | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Alemania | N/A | |
| Ácido propilioofenóxico, 99 % (p/p) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lote PR100612108RR |
| pipeta | Eppendorf | M4 | |
| Tapones de vial de muestreador automático con tapa de rosca, revestidos de PTFE | Agilent | 5190-7024 | |
| Cloruro de sodio, certificado Grado ACS | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package SAS Institute | , Cary, Carolina del Norte, EE. UU | N/A | |
| Ácido trifluoroacético, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Mezclador de vórtice | Glas-Col | 099A PV6 | |
| Puntas de pipeta de 0,2 mL | Eppendorf | 30089.413 | |
| Puntas de pipeta de 0,5 mL | Eppendorf | 30089.421 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-& micro; Puntas de pipeta con | L GeneMate | P-1233-1250 | |
| Puntas de pipeta de 1 mL | Eppendorf | 30089.43 | |
| Viales de muestreador automático con tapa de rosca ámbar de 2 mL | Agilent | 5182-0716 | |
| Puntas de pipeta de 5 mL | Eppendorf | 30089.456 | |
| Gradilla de tubos para microcentrífuga de 80 posiciones | Fisher | 05-541-2 | |
| Viales ámbar de 8 ml con Tapas revestidas de PTFE | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) de isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 y micro; L pipeta de desplazamiento neumático | Eppendorf | ES-100 |
Referencias
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, W....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
