Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Summary

La microscopía de localización de una sola molécula 3D se utiliza para sondear las posiciones espaciales y las trayectorias de movimiento de las proteínas etiquetadas fluorescentes mente en células bacterianas vivas. El protocolo experimental y de análisis de datos descrito en este documento determina los comportamientos difusivos prevalentes de las proteínas citosólicas basadas en trayectorias agrupadas de una sola molécula.

Abstract

La microscopía de localización de una sola molécula sondea la posición y los movimientos de moléculas individuales en células vivas con decenas de nanómetros de resolución espacial y temporal de milisegundos. Estas capacidades hacen que la microscopía de localización de una sola molécula sea ideal para estudiar las funciones biológicas a nivel molecular en entornos fisiológicamente relevantes. Aquí, demostramos un protocolo integrado para la adquisición y procesamiento / análisis de datos de seguimiento de una sola molécula para extraer los diferentes estados difusivos que una proteína de interés puede exhibir. Esta información se puede utilizar para cuantificar la formación de complejos moleculares en células vivas. Proporcionamos una descripción detallada de un experimento de localización 3D de una sola molécula basado en cámara, así como los siguientes pasos de procesamiento de datos que producen las trayectorias de moléculas individuales. Estas trayectorias se analizan utilizando un marco de análisis numérico para extraer los estados difusos prevalentes de las moléculas etiquetadas fluorescentes y la abundancia relativa de estos estados. El marco de análisis se basa en simulaciones estocásticas de trayectorias de difusión Browniana intracelular que están limitadas espacialmente por una geometría celular arbitraria. Sobre la base de las trayectorias simuladas, las imágenes de una sola molécula en bruto se generan y analizan de la misma manera que las imágenes experimentales. De esta manera, las limitaciones de precisión y precisión experimentales, que son difíciles de calibrar experimentalmente, se incorporan explícitamente al flujo de trabajo de análisis. El coeficiente de difusión y las fracciones de población relativa de los estados difusos prevalentes se determinan ajustando las distribuciones de los valores experimentales mediante combinaciones lineales de distribuciones simuladas. Demostramos la utilidad de nuestro protocolo resolviendo los estados difusivos de una proteína que exhibe diferentes estados difusivos al formar complejos homo y hetero-oligoméricos en el citosol de un patógeno bacteriano.

Introduction

El examen del comportamiento difuso de las biomoléculas proporciona información sobre sus funciones biológicas. Las técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia se han convertido en herramientas valiosas para observar biomoléculas en su entorno celular nativo. La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) y la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)¹ proporcionan comportamientos difusivos promediados por el conjunto. Por el contrario, la microscopía de localización de una sola molécula permite la observación de moléculas individuales etiquetadas fluorescentes con alta resolución espacial y temporal

Protocol

1. Calibración de la función de dispersión por puntos de doble hélice

NOTA: Las imágenes descritas en esta y las siguientes secciones se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia invertida construido a medida, como se describe en Rocha et al.²³. El mismo procedimiento es aplicable a diferentes implementaciones de microscopio diseñadas para la localización de una sola molécula y la microscopía de seguimiento^2,3,4. Todo el software para la adquisición de imágenes y el procesamiento de datos descrito en este artículo e....

Results

En las condiciones experimentales descritas aquí (20.000 fotogramas, longitud de trayectoria mínima de 4 localizaciones) y dependiendo de los niveles de expresión de las proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente, aproximadamente 200-3.000 localizaciones que producen 10-150 trayectorias se pueden generar por celda(Figura 2a,b). Se hace necesario un gran número de trayectorias para producir una distribución bien muestreada de los coefic.......

Discussion

Un factor crítico para la aplicación exitosa del protocolo presentado es asegurar que las señales de una sola molécula estén bien separadas entre sí (es decir, deben ser escasas en el espacio y en el tiempo(Movimiento Suplementario 1)). Si hay más de una molécula de fluorescencia en una célula al mismo tiempo, entonces la localización podría asignarse incorrectamente a la trayectoria de otras moléculas. Esto se conoce como el problema de vinculación³⁰. Se pueden elegir condiciones.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido 2,6-diaminopimélico	Chem Impex International	5411	Necesario para el crecimiento de las células Y. enterocolitica utilizadas.
Lentes 4f	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm láser	Coherente	Genesis MX514 MTM	Uso para excitación de fluorescencia
agarosa	Inivtrogen	16520100	Se utiliza para hacer almohadillas de gel para montar muestras bacterianas líquidas en el microscopio.
cloruro de amonio	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingrediente.
filtro de paso de banda	Chroma	ET510/bp	Vía de excitación.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Medios de crecimiento para Y. enterocolitica.
cloruro de calcio	Sigma Aldrich	223506	ingrediente M2G.
cámara	Fuente de imagen	DMK 23UP031	Cámara para imágenes de contraste de fase.
máscara de fase dieléctrica	Double Helix, LLC	N/A	Produce señal DHPSF.
fosfato disódico	Sigma Aldrich	795410	M2G ingrediente.
ácido etilendiaminotetraacético	Fisher Scientific	S311-100	quelatos Ca2+. Induce la secreción en el T3SS.
espejo abatible	Newport	8892-K	Permite cambiar entre las vías de fluorescencia y contraste de fase.
fluosferas	Invitrogen	F8792	Perlas fluorescentes. 540/560 longitudes de onda de exicación y emisión. 40 nm de diámetro.
cubreobjetos de vidrio	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucosa	Chem Impex International	811	M2G ingrediente.
aceite de inmersión	Olympus	Z-81025	Colocado en la lente del objetivo.
sulfato de hierro (II)	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingrediente.
filtro de paso largo	Semrock	LP02-514RU-25	Vía de emisión.
sulfato de magnesio	Fisher Scientific	S25414A	ingrediente M2G.
plataforma de microscopio	Mad City Labs	plataforma personalizada	para microscopio invertido.
Las células de ácido nalidíxico	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica utilizadas son resistentes al ácido nalidíxico.
lente objetivo	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Limpiador de ozono	Novascan	PSD-UV4	Se utiliza para eliminar la fluorescencia de fondo en los deslizamientos de la cubierta de vidrio.
fosfato de potasio	Sigma Aldrich	795488	ingrediente M2G.
LED rojo	Thorlabs	M625L3	Ilumina la muestra para imágenes de contraste de fase. 625nm.
Cámara sCMOS	Cámara Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Cámara para imágenes de fluorescencia.
filtro de paso corto	Chroma	ET700SP-2P8 Vía de	emisión.
Lente	de tubo Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A Cepa	AD4442, eYFP-YscQ
placa de cuarto de onda de orden cero	Thorlabs	WPQ05M-514 Vía de	excitación.