Aquí, presentamos un protocolo para medir el compromiso objetivo de KDM1A en una célula humana o animal, muestras de tejido o sangre tratadas con inhibidores de KDM1A. El protocolo emplea el etiquetado quimioprobe de la enzima KDM1A libre y la cuantificación directa de la ocupación objetivo mediante inmunoensayos basados en quimiosondas y se puede utilizar en estudios preclínicos y clínicos.
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Artículo de método
Medición directa del compromiso objetivo de KDM1A mediante inmunoensayos basados en chemoprobe
En este artículo
Resumen
Resumen
La evaluación de la participación objetivo, definida como la interacción de un medicamento con la proteína para la que fue diseñado, es un requisito básico para la interpretación de la actividad biológica de cualquier compuesto en el desarrollo de fármacos o en proyectos de investigación básica. En la epigenética, la participación objetivo se evalúa con mayor frecuencia mediante el análisis de marcadores proxy en lugar de medir la unión del compuesto con el objetivo. Las lecturas biológicas aguas abajo que se han analizado incluyen la modulación de la marca de histona o los cambios en la expresión génica. KDM1A es una lisina demetilasa que elimina los grupos metilo de H3K4 mono y dimetilado, una modificación asociada con el silenciamiento de la expresión génica. La modulación de los marcadores proxy depende del tipo de célula y la función de la composición genética de las células investigadas, lo que puede dificultar la interpretación y la comparación entre mayúsculas y minúsculas. Para evitar estos problemas, se presenta un protocolo versátil para evaluar los efectos de la dosis y la dinámica de la participación directa de la meta de KDM1A. El ensayo descrito hace uso de una quimiosonda KDM1A para capturar y cuantificar enzimas desinhibidas, se puede aplicar ampliamente a células o muestras de tejido sin necesidad de modificación genética, tiene una excelente ventana de detección, y se puede utilizar tanto para la investigación básica y análisis de muestras clínicas.
Introducción
Lisina específica demetilasa 1 (KDM1A)1 es una demetilasa implicada en el control de la transcripción génica. Esta proteína ha surgido como un objetivo farmacológico candidato2 en oncología; incluyendo Leucemia mieloide aguda3 (LMA), Síndrome de mielodisplasia (MdS)4, Mielofibrosis (MF)5,6, Cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC)7; en la enfermedad de células falciformes (SCD)8,9, y en enfermedades del sistema nervioso central inc....
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Protocolo
Se obtuvieron muestras de sangre del Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau Biobank de acuerdo con la legislación española (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) y la aprobación de los comités de ética local. Los estudios con tejidos animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Directiva 86/609/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas) establecidas por el Comité ético para la experimentación animal en el PRAAL-PCB.
1. Preparación de muestras biológicas para el ensayo.
ADVERTENCIA: Este protocolo implica la manipulación ....
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Resultados
La linealidad de la determinación Total y Libre de KDM1A.
Se preparó una serie estándar como se describe en el paso 5.3.2., utilizando 0 a 2500 pg de enzima KDM1A recombinante humana de longitud completa. Los valores RLU de Total y Free rKDM1A se evaluaron para verificar la linealidad (Figura2A y 2B). Los datos se representan como media de 3 experimentos con 3 répli.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí fue desarrollado para medir directamente el compromiso objetivo de KDM1A utilizando una nueva captura de quimiosondas KDM1A basada en ELISA. El método ha sido validado en líneas celulares humanas cultivadas y muestras ex vivo de humanos, ratas y ratones y babuinos (incluyendo PPBCM, pulmón, cerebro, piel, tumores), pero se puede aplicar fácilmente a otras especies en las que los epítopos objetivo de anticuerpos KDM1A y catalíticos centro se conservan. Como OG-881 es una quimiosonda basada en .......
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Divulgaciones
La autora Tamara Maes es directora ejecutiva y accionista, y las autoras Cristina Mascaró y Raquel Ruiz Rodríguez son empleados de Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. desarrolla inhibidores de KDM1A y posee patentes que cubren compuestos y métodos utilizados en este artículo.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, y parcialmente apoyado por el CIIP-20152001 y el programa de colaboración RETOS RTC-2015-3332-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 x Comprimidos inhibidores de la proteasa | Roche | #11836153001 | |
| Bloque de almacenamiento de 96 pozos profundos | VWR | #734-1679 | |
| Placas ELISA de 96 pocillos | Nunc | #436110 | |
| Adhesivo negro Película | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesivo Película transparente | VWR | #60941-062 | |
| Sonda KDM1A biotinilada OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | ||
| NA Albúmina sérica bovina | Sigma | # 3117057001 | |
| Albúmina sérica bovina estándar | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Tampón de lisis celular 10X | Cell | Signaling#9803 | |
| Centrífuga para placas de 96 pocillos | Hettich | Rotina 420R | |
| Matraz | Thermo Scientific | #156499 | |
| longitud completa, enzimáticamente activo Recombinante LSD1 / KDM1A | Motivo activo | #31426 | |
| Proyecto Graphpad Prisma 5 | Software GraphPad NA | ||
| Luminol-Enhacer y solución de peróxido (sustrato quimioluminiscente) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415 R Lector | |
| de microplacas Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Anticuerpo de captura monoclonal de ratón Anti-KDM1A (epítopo N-terminal) | Abcam | #ab53269 | |
| Aguja G18 calibre romo | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | ||
| Tubos de separación NA PBMC 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| Tubos de separación PBMC 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Agitador de placas | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polisorbato 20 | Sigma | #P7949 | |
| Anticuerpo monoclonal de detección de conejo Anti-KDM1A (epítopo C-terminal) | Señalización celular | #672184BF-100 | |
| Anticuerpo secundario Conóxido peroxidasa Burro anti-conejo Anti-conejo IgG Thermo | Scientific | #31458 | |
| Espectrofotómetro cubeta 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Espectrofotómetro para cubeta | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Estreptavidina | Promega | #Z704A | |
| Jeringa | BD | #303172 | |
| Tipo 1 agua ultrapura | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Limpiador ultrasónico | VWR | USC200T |
Referencias
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
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Reimpresiones y permisos
