Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

Resumen

Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.

Resumen

Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.

Introducción

Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, célul....

Protocolo

1. la cultura, la diferenciación y la validación de las células HL-60

1. Preparar medios de cultivo de células HL-60 compuesto por 500 mL RPMI con L-glutamina y 50 mL inactivadas por calor suero bovino fetal. No agregue antibióticos ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.
2. Para la propagación y mantenimiento de las células HL-60, cultura 5 x 10⁶ células en 10 mL de medio de cultivo celular HL-60 75 cm² ventilación frascos a 37 º C y 5% CO₂. Pasaje las células cada 3−4 dias a mantener concentraciones óptimas de la célula.
   Nota: La concentración celular no debe exceder....

Resultados

Validación de la diferenciación de la HL-60 se debe realizar antes de comenzar la OPKA. Esto puede lograrse mediante citometría de flujo para determinar la expresión extracelular de CD11b, CD35, CD71 y anexina V (figura 1). Yoduro de propidio también puede utilizarse como un marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante 3 días, se debe aumentar la expresión de CD35 (≥55% de todas las células) y disminución de expresión de CD71 (≤20% de todas las células). El porcentaje de pr.......

Discusión

OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas^6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anexina V (conjugada con APC)	BioLegend	640919
anti-CD35, humano (conjugado con PE)	BioLegend	333405
anti-CD71, humano (conjugado con PE)	BioLegend	334105
cepa bacteriana a utilizar (es decir, Streptococcus pneumoniae, WU2)	Laboratorio de Referencia Respiratoria Bacteriana (Dr. Moon Nahm)
placas de agar sangre Hardy	Diagnostic	A10
Fetal Clone serum	HyClone	SH30080.03
glicerol	Sigma	G9012-1L
células HL-60	ATCC	CCL-240
IgG Control de isotipo (conjugado PE)	BioLegend	400907
N,N-dimetilformamida (DMF)	Fisher Químico	UN2265
yoduro de propidio	Sigma	P4864
RPMI medios con L-glutamina	Corning	10-040-CV