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Artículo de método

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

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DOI:

10.3791/59400

⸱

5 de abril de 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

En este artículo

Resumen

Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.

Resumen

Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.

Introducción

Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, células inmunes y experimental tratamientos. Estudios anteriores han demostrado que OPKAs pueden ser modificados y utilizados para una variedad de bacterias y serotipos, incluyendo Streptococcus pneumoniae1,2de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa3. Además, estos ensayos optimizados pueden utilizarse para evaluar distintos tratamientos experimentales, incluyendo la capacidad de una enzima para que la bacteria sea más accesible a los tratamientos4 y anticuerpo complemento-mediada de las células inmunes para mejorar opsonización5. Clásico, ensayo OPKA se ha utilizado con éxito en investigación básica y clínica ajustes como un indicador de gran alcance para la protección inducida por anticuerpos patógenos específicos6,7,8,9 .

Diferentes tipos de células inmunes pueden usarse para evaluación de opsonofagocítico matar. Una población fagocítica comúnmente utilizada es la línea de células leucémicas humanas HL-60. Esta línea celular se puede mantener como promyelocytes inactivada en la cultura; sin embargo, puede ser distinguidos en varios Estados activados a través de diferentes drogas tratamientos10,11. Tratamiento de HL60 con N, N-dimetilformamida distingue la línea celular en neutrófilos activados con fuerte actividad fagocítica11. Mientras que las células HL-60 se han optimizado y se utilizan con frecuencia para estos ensayos de fagocitosis10, pueden utilizarse otros leucocitos polimorfonucleares primarios como el brazo inmune del experimento12.

Además, estos ensayos pueden ser simplificado13 o multiplexado14 mirar varias cepas resistentes a los antibióticos de la bacteria a probar. El método de multiplexado se ha hecho más factible a través del desarrollo de software que puede contar eficientemente Colonia bacteriana formando unidades (UFC) por spot en una placa de agar15. Aquí, describimos un método racionalizado usando una cepa bacteriana, las células HL-60, complemento de conejo bebé y placas de agar sangre. Con este método, varios tratamientos pueden ser evaluados rápidamente para hacer frente a preguntas de investigación específicas sobre cómo se pueden modular la respuesta inmune innata a la infección bacteriana.

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Protocolo

1. la cultura, la diferenciación y la validación de las células HL-60

  1. Preparar medios de cultivo de células HL-60 compuesto por 500 mL RPMI con L-glutamina y 50 mL inactivadas por calor suero bovino fetal. No agregue antibióticos ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.
  2. Para la propagación y mantenimiento de las células HL-60, cultura 5 x 106 células en 10 mL de medio de cultivo celular HL-60 75 cm2 ventilación frascos a 37 º C y 5% CO2. Pasaje las células cada 3−4 dias a mantener concentraciones óptimas de la célula.
    Nota: La concentración celular no debe exceder 5 x 106/ml.
  3. Generar acciones de trabajo de las células HL-60 tomar aproximadamente 1 x 106 células/mL en medios de cultivo HL60 con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los tubos criogénicos de 1 mL.
    Nota: Las acciones de trabajo pueden ser almacenadas a-80 ° C. La principal acción debe ser almacenada a-120 ° C.
  4. Diferenciar células HL-60 por cultivo 1,5 x 107 células en 15 mL de medio de cultivo celular HL-60 con 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C y 5% de CO2 en frascos de tapón filtro estéril 75 cm2 durante 3 días antes de la OPKA.
  5. Validar que las células HL-60 han sido distinguidas con éxito y son apropiadas para su uso en el ensayo OPKA mediante ensayos de viabilidad y marcadores de superficie celular según establecido flujo cytometry protocolos16,17, 18,19. Después de la diferenciación, cosechar células HL-60 y mancha de aproximadamente 1 x 104 células con fluorescencia conjugado anticuerpos/manchas CD71, CD35, anexina V y yoduro de propidio.
    Nota: Las células diferenciadas deben ser ≥65% viables, ≥55% CD35+y ≤20% CD71+ determinado a través de establecer protocolos de validación14 (figura 1).

2. preparación de OPKA Buffers y reactivos

  1. Preparar 50 mL de buffer estéril opsonización B (OBB) mezclando 42,5 mL de estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca2 +/Mg2 +5 mL de suero bovino fetal inactivado con calor y 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Almacenar a 4 ° C.
  2. Obtener conejo bebé complemento y almacenar a-80 ° C.
  3. Obtener o preparar platos para cultivo bacteriano (es decir, placas de agar sangre de oveja al de 5% 15 x 100 mm2 ).

3. preparación de muestras de acción bacterianas

  1. Obtener un stock de las cepas bacterianas positivo para ser probado.
    Nota: De este protocolo, serotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente proporcionada por el Dr. Moon Nahm) se utiliza.
  2. Crecer la cepa bacteriana en un caldo apropiado (es decir, caldo Todd-Hewitt + 0,5% extracto de levadura para esta cepa WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C.
    Nota: La densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura debe ser entre 0.6 y 0.8.
  3. De la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 6.000 x g durante 2 min y resuspender las células en 10−30 mL de glicerol al 15% en el caldo apropiado. Alícuota del cultivo bacteriano (alícuota de 500 μl) en tubos de centrífuga estériles de 1.5 mL y conservar a-80 ° C.
  4. Descongelar un vial de acción bacteriana en baño de agua de 37 ° C. Las células bacterianas de la pelotilla y resuspender en 500 μl de OBB en condiciones estériles.
  5. Preparar diluciones diferentes de la población bacteriana en OBB (es decir, 10 μl de ninguna dilución, 10 μl de 1:10, 10 μl de 1: 100, etcetera). Realizar el ensayo OPKA (secciones 4-6, incluyendo co-cultivo HL-60/complemento) como se describe a continuación utilizando varias diluciones de la acción bacteriana no tratada. La cultura las placas durante la noche a 30 ° C (sin CO2).
    Nota: La temperatura de 30 ° C es específica para WU2 evitar crecimiento excesivo; otras cepas/serotipos pueden crecer óptimamente a 37 ° C.
  6. Contar las colonias para cada dilución de la acción bacteriana no tratada cultivada conjuntamente con complemento y células HL-60. Determinar qué dilución de las bacterias produce el número óptimo de colonias contables (aproximadamente 80−120 unidades formadoras de colonias de bacterias cultivadas conjuntamente con las células HL-60). Tenga en cuenta esta dilución para futuras OPKAs que implica esta acción bacteriana.

4. cultura y el tratamiento bacteriana

  1. Descongelar un tubo de caldo bacteriano preparado en el paso 3.3. Pellet de bacterias (6.000 x g durante 2 min) y resuspender el precipitado de células en OBB en una disolución óptima determinada en el paso 3.6.
  2. Pipetear 10 μl de la dilución bacteriana resuspendida por pozo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo.
  3. Añadir 20 μl del anticuerpo o drogas el tratamiento apropiado a cada pozo experimental por duplicado.
    Nota: En este protocolo, se agrega un anticuerpo serotipo-específicos generado en ratones como tratamiento X y una enzima hidrolasa de glucósido conocida para degradar la cápsula de polisacárido 3 serotipo se agrega como tratamiento Y (figura 2)4,20. Para los pozos de control, use 1 x PBS o OBB, dependiendo el buffer utilizado para los pozos de tratamiento.
  4. Agitar la placa de la muestra a aproximadamente 90 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Ajustar estas condiciones dependiendo de la temperatura óptima o agitación de los tratamientos de prueba.

5. HL-60 la cultura bacteriana Co

  1. Recolección de las células HL-60 diferenciados que son tratadas con DMF tres días antes (ver paso 1.4) en tubos cónicos de 15 mL para preparar células HL-60. Sedimenten las células (x 500 g, 3 min), deseche el sobrenadante y lavar con menos de 10 mL de PBS 1 x.
  2. Sedimenten las células lavadas (500 x g, 3 min), eliminar el sobrenadante y resuspender las células en OBB (comenzar con 1 mL OBB y ajustar para una concentración final de 1 x 107/ml después de la célula que cuenta).
  3. Agregar complemento de conejo bebé (de suero de conejo estéril, sin diluir bebé, semanas de edad 3−4) en un volumen final de 1:5.
    Nota: La concentración final de la mezcla de HL-60-complemento debe ser de 1 x 107/ml. Si pruebas de dependencia de complemento, puede utilizarse una segunda solución que contiene activadas células HL-60 con complemento inactivadas por calor (complemento puede ser inactivado por incubar en un baño de agua a > 55 ° C durante al menos 30 minutos).
  4. Después de 1 h la cultura bacteriana es completa (paso 4.4), dividen cada muestra (es decir, 10 μl de cada 30 μl de la muestra en dos nuevos pozos) en los pocillos duplicados para los dos grupos (es decir, uso solo 20 μl de la original cultura Co 30 μL para tener en cuenta para el error de pipeteo) : un sistema será Co cultivado con HL-60-complemento y uno incluirá sólo las bacterias. Añadir 50 μl de la mezcla de la HL-60-complemento (de paso 5.3) para cada sistema experimental de pozos (delegado + HL-60); Añadir 50 μl de OBB solo a los pozos de las bacterias sólo (delegado -HL-60).
    Nota: Para este ejemplo, se utiliza aproximadamente 800 UFC bacterianas para la inicial co-cultivo con células HL-60 de 5 x 10550 μl. Si esta multiplicidad de la infección es demasiado alta o demasiado baja según lo indicado por los números finales de la Colonia, ajustar la dilución bacteriana inicial en comparación con el recuento de células HL-60.
  5. Agitar la placa de 96 pozos a 37 ° C durante 1 hora (sin CO2).

6. placas y la incubación de la muestra

  1. Diluir cada bien 1:5 con OBB, para que cada muestra tiene un volumen de 50 μl.
  2. Pipetee 50 μl de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, garantizar el espacio adecuado entre las muestras. De 15 x 100 mm2 alrededor de las placas de agar, muestras de pipeta aproximadamente 4 en un plato.
  3. Cubra y deje las muestras a secar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente.
  4. Invertir las placas y la cultura durante la noche a 30 ° C (sin CO2). Por otra parte, la cultura placas en jarras anaeróbicas para comprobar las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o control para morfología.
  5. Después de la cultura durante la noche, contar las colonias en cada área designada de la muestra. Analizar los datos comparando el número de células vivas en cada sistema para el control correspondiente o muestras que no reciben cultura Co de células HL-60 (indicativo de supervivencia de la célula de 100%, 0% matanza de la célula).

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Resultados

Validación de la diferenciación de la HL-60 se debe realizar antes de comenzar la OPKA. Esto puede lograrse mediante citometría de flujo para determinar la expresión extracelular de CD11b, CD35, CD71 y anexina V (figura 1). Yoduro de propidio también puede utilizarse como un marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante 3 días, se debe aumentar la expresión de CD35 (≥55% de todas las células) y disminución de expresión de CD71 (≤20% de todas las células). El porcentaje de pr...

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Discusión

OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos su inestimable colaboración en el establecimiento de ensayos OPKA en nuestro laboratorio Dr. Moon Nahm (Universidad de Alabama Birmingham). Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1R01AI123383-01A1 a FYA.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anexina V (conjugada con APC)BioLegend640919
anti-CD35, humano (conjugado con PE)BioLegend333405
anti-CD71, humano (conjugado con PE)BioLegend334105
cepa bacteriana a utilizar (es decir, Streptococcus pneumoniae, WU2)Laboratorio de Referencia Respiratoria Bacteriana (Dr. Moon Nahm) 
placas de agar sangre HardyDiagnosticA10
Fetal Clone serumHyCloneSH30080.03
glicerolSigmaG9012-1L
células HL-60ATCCCCL-240
IgG Control de isotipo (conjugado PE)BioLegend400907
N,N-dimetilformamida (DMF)Fisher QuímicoUN2265
yoduro de propidioSigmaP4864
RPMI medios con L-glutaminaCorning10-040-CV

Referencias

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

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