Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

Resumen

Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.

Resumen

La visualización de los procesos de infección en tejidos y órganos mediante inmunoetiquetado es un método clave en la biología moderna de la infección. La capacidad de observar y estudiar la distribución, el tropismo y la abundancia de patógenos dentro de los tejidos de órganos proporciona datos fundamentales sobre el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Mediante métodos de microscopía convencionales, el inmunoetiquetado se limita principalmente a secciones delgadas obtenidas de muestras congeladas o incrustadas en parafina. Sin embargo, el plano de imagen 2D limitado de estas secciones delgadas puede conducir a la pérdida de información crucial sobre la estructura compleja de un órgano infectado y el contexto celular de la infección. Las modernas técnicas multicolores y compatibles con la inmunomancha ahora proporcionan una manera relativamente rápida y económica de estudiar pilas de imágenes 3D de gran volumen de tejido orgánico infectado por virus. Al exponer el tejido a disolventes orgánicos, se vuelve ópticamente transparente. Esto coincide con los índices de refracción de la muestra y, finalmente, conduce a una reducción significativa de la dispersión de la luz. Por lo tanto, en combinación con objetivos de larga distancia de trabajo libre, grandes secciones de tejido de hasta 1 mm de tamaño se pueden tomar imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal convencional (CLSM) a alta resolución. Aquí, describimos un protocolo para aplicar imágenes de tejido profundo después de la limpieza del tejido para visualizar la distribución del virus de la rabia en cerebros infectados con el fin de estudiar temas como la patogénesis del virus, la propagación, el tropismo y la neuroinvasión.

Introducción

Las técnicas de histología convencionales se basan principalmente en secciones delgadas de tejidos de órganos, que pueden proporcionar intrínsecamente sólo información 2D en un entorno 3D complejo. Aunque es factible en principio, la reconstrucción 3D a partir de secciones delgadas en serie requiere tuberías técnicas exigentes tanto para el corte como para posteriores en la alineación de silico de las imágenes adquiridas¹. Además, la reconstrucción sin fisuras de los volúmenes z después del corte del microtomo es fundamental, ya que los artefactos mecánicos y computacionales pueden permanecer debido al registro de imágenes subóptimo causado por planos de imagen no superpuestos, variaciones de tinción y destrucción de tejido por, por ejemplo, la hoja del microtome. Por el contrario, el corte óptico puro de muestras de tejido grueso intactas permite la adquisición de planos de imagen superpuestos (sobremuestreo) y, por lo que, facilita la reconstrucción 3D. Esto, a su vez, es altamente beneficioso para el análisis de procesos de infección en poblaciones celulares complejas (por ejemplo, redes neuronales en el contexto de las células gliales e inmunitarias circundantes). Sin embargo, los obstáculos inherentes de las secciones de tejido grueso incluyen dispersión de la luz y penetración limitada de anticuerpos en el tejido. En los últimos años, se ha desarrollado y optimizado una variedad de técnicas para superar estos problemas^{2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Esencialmente, los tejidos diana se vuelven ópticamente transparentes por tratamiento con acuoso^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} o soluciones a base de disolventes orgánicos^10,11,12,13. La introducción de 3DISCO (imágenes 3D de órganos con disolventes)^11,12 y su sucesor uDISCO (imágenes 3D finales de órganos con disolventes)¹³ proporcionaron una herramienta relativamente rápida, simple y barata con excelentes capacidades de compensación. Los principales componentes del protocolo de limpieza son los disolventes orgánicos tert-butanol (TBA), alcohol bencílico (BA), benzoato de bencilo (BB) y éter de difenilo (DPE). El desarrollo y adición de iDISCO (imágenes 3D habilitadas para inmunoetiquetado de órganos con disolventes)¹⁴, un protocolo de inmunomanchas compatible, constituyó otra ventaja sobre los métodos existentes y permitió el etiquetado de tejido profundo de antígenos de interés, así como el almacenamiento a largo plazo de muestras inmunomanchadas. Por lo tanto, la combinación de iDISCO¹⁴ y uDISCO¹³ permite la toma de imágenes de alta resolución de proteínas etiquetadas con anticuerpos en grandes secciones de tejido (hasta 1 mm) utilizando CLSM convencional.

La preservación de la estructura compleja de un órgano en las tres dimensiones es particularmente importante para el tejido cerebral. Las neuronas comprenden una subpoblación celular muy heterogénea con morfologías 3D muy diversas basadas en sus proyecciones de neurita (revisadas por Masland^15). Además, el cerebro consta de una serie de compartimentos y subcompartimentos, cada uno compuesto por diferentes subpoblaciones celulares y proporciones de los mismos, incluyendo células gliales y neuronas (revisado por von Bartheld et al.¹⁶). Como virus neurotrópico, el virus de la rabia (RABV, revisado por Fooks et al.¹⁷) infecta principalmente a las neuronas, utilizando su maquinaria de transporte para viajar en dirección retrógrada a lo largo de los axons desde el sitio primario de la infección hasta el sistema nervioso central (SNC). El protocolo descrito aquí (Figura1A) permite la detección asistida por inmunomanchas y la visualización de células infectadas por RABV y RABV en pilas de imágenes grandes y coherentes obtenidas del tejido cerebral infectado. Esto permite una evaluación imparcial y en 3D de alta resolución del entorno de la infección. Es aplicable al tejido cerebral de una variedad de especies, se puede realizar inmediatamente después de la fijación o después del almacenamiento a largo plazo de muestras en paraformaldehído (PFA), y permite el almacenamiento y reimagen de muestras manchadas y despejadas durante meses.

Protocolo

Se utilizó material cerebral archivado fijado por la PFA infectado por RABV. Los respectivos estudios experimentales en animales fueron evaluados por el comité responsable de cuidado, uso y ética de los animales de la Oficina Estatal de Agricultura, Seguridad Alimentaria y Pesca en Mecklemburgo-Pomerania Occidental (LALFF M-V) y obtuvieron la aprobación con permisos 7221.3-2.1-002/11 (ratones) y 7221.3-1-068/16 (ferrets). Los cuidados generales y los métodos utilizados en los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas.

ADVERTENCIA: Este protocolo utiliza diversas sustancias tóxicas y/o nocivas, incluyendo PFA, metanol (MeOH), peróxido de hidrógeno (H₂O_2),azida sódica (NaN_3),TBA, BA, BB y DPE. MeOH y TBA son altamente inflamables. Evite la exposición usando el equipo de protección personal adecuado (un abrigo de laboratorio, guantes y protección para los ojos) y realizando experimentos en una campana de humo. Recoger los residuos por separado en los contenedores apropiados y desecharlos de acuerdo con la normativa local. El virus de la rabia se clasifica como un patógeno de nivel de bioseguridad (BSL)-2 y, por lo tanto, generalmente puede ser manejado bajo condiciones BSL-2. Algunas actividades, incluidos los procedimientos que pueden generar aerosoles, trabajar con altas concentraciones de virus o trabajar con nuevos lissavirus, pueden requerir la clasificación BSL-3. Se recomienda la profilaxis previa a la exposición para el personal de alto riesgo, incluidos los cuidadores de animales y los trabajadores de laboratorio^18,19. Consulte las regulaciones de las autoridades locales.

1. Fijación del tejido cerebral y seccionamiento

1. Fijar muestras cerebrales en un volumen apropiado de 4% PFA en solución salina tamponada de fosfato (PBS [pH 7.4]) durante al menos 48 h a 4 oC (con una relación de tejido-fijador aproximada de 1:10 [v/v]).
2. Lavar las muestras de tejido 3 veces en PBS durante al menos 30 minutos cada lavado y almacenarlas en 0.02% NaN₃/PBS a 4 oC hasta su uso.
3. Seccionar el tejido en secciones de 1 mm de espesor utilizando un vibratomo (velocidad de avance de la hoja: 0,3–0,5 mm/s, amplitud: 1 mm, espesor de la rebanada: 1.000 m).
4. Para conservar la secuencia de rebanadas correcta, guarde cada sección de tejido por separado en un pozo de una placa de cultivo de células multipocillos. Añadir 0.02% NaN₃/PBS y almacenar las secciones de tejido a 4 oC hasta su uso.

2. Pretratamiento de muestras con metanol

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. El pretratamiento de la muestra sirve para mejorar la difusión de anticuerpos y reducir la autofluorescencia tisular mediante la exposición a MeOH y H₂O₂, respectivamente^14.

1. Prepare soluciones MeOH al 20% (v/v), al 40%, al 60% y al 80% en agua destilada. Por ejemplo, para el 20% de MeOH, añadir 10 ml de 100% MeOH a 40 ml de agua destilada en un recipiente sellado relable adecuado y mezclar invirtiéndolo.
2. Transfiera las muestras a recipientes de tamaño razonable (por ejemplo, tubos de reacción de 5 ml). Tenga cuidado de utilizar materiales químicamente resistentes a los reactivos utilizados en este protocolo. Por ejemplo, tenga en cuenta que, si bien el polipropileno es adecuado, el poliestireno no lo es.
   NOTA: Las especificaciones de volumen de este protocolo se refieren a tubos de reacción de 5 ml. Si se utiliza un recipiente diferente, ajuste los volúmenes en consecuencia.
3. Incubar las muestras en 4 ml de cada concentración de la serie preparada de soluciones MeOH en orden ascendente durante 1 h cada una.
4. Incubar las muestras 2x durante 1 h cada una en puro (100%) Meoh.
5. Enfríe las muestras a 4 oC (p. ej., en un refrigerador seguro para laboratorio).
6. Preparar la solución de blanqueo (5% H₂O₂ en MeOH) diluyendo, por ejemplo, una solución de material de 30% H₂O₂ a 1:6 en puro (100%) MeOH, y enfriarlo a 4 oC.
7. Retire el 100% MeOH de las muestras refrigeradas y agregue 4 ml de solución de blanqueo pretalado (5% H₂O₂ en MeOH). Incubar durante la noche a 4oC.
8. Cambiar la solución de blanqueo por 4 ml de 80% MeOH e incubar por 1 h. Continuar utilizando la serie preparada de soluciones MeOH en orden descendente durante 1 h cada una hasta que las muestras hayan sido incubadas durante 1 h en 4 mL de 20% MeOH.
9. Lavar las muestras 1x durante 1 h con 4 ml de PBS.

3. Inmunomanchación

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Para evitar el crecimiento microbiano, añada NaN₃ a una concentración final del 0,02% a las soluciones de esta sección. Las muestras de tejido se permeabilizan aún más mediante el tratamiento con detergentes no iónicos Triton X-100 y Tween 20. El suero normal se utiliza para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos. Se añaden glicina y heparina para reducir el fondo de inmunoetiquetado¹⁴.

1. Lavar las muestras 2x durante 1 h cada una en 4 ml de 0,2% De Tritón X-100/PBS.
2. Permeabilizar las muestras durante 2 días a 37oC con 4 mL de 0,2% de Tritón X-100/20% DMSO/0.3 M glicina/PBS.
3. Bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos incubando las muestras durante 2 días a 37 oC en 4 ml de 0,2% de Tritón X-100/10% DMSO/6% suero normal/PBS.
   NOTA: Utilice suero normal de la misma especie en la que se elevó el anticuerpo secundario para lograr resultados de bloqueo ideales.
4. Incubar las muestras en 2 ml de solución primaria de anticuerpos (3% de suero normal/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con heparina] + anticuerpos/anticuerpos primarios) durante 5 días a 37 oC. Actualice la solución de anticuerpos primarios después de 2,5 días.
   1. Para PTwH, reconstituir la sal sódica de heparina en agua destilada para hacer una solución de material de 10 mg/ml (almacenar esta solución, alícotada, a 4oC). Añadir la solución de stock a 0.2% Tween 20/PBS a una concentración final de 10 g/ml.
      NOTA: La elección de la dilución correcta de anticuerpos puede requerir optimización. Generalmente, las concentraciones estándar de inmunohistoquímica son un buen punto de partida.
5. Lavar las muestras durante 1 día en 4 ml de PTwH, intercambiando el tampón de lavado al menos 4veces-5 veces durante el transcurso del día y dejando el lavado final durante la noche.
6. Incubar las muestras en 2 ml de solución secundaria de anticuerpos (3% suero/PTwH normal + anticuerpos/anticuerpos secundarios) durante 5 días a 37 oC. Actualice la solución de anticuerpos secundarios después de 2,5 días.
   1. Diluir el anticuerpo/anticuerpo secundario a 1:500 en solución secundaria de anticuerpos (es decir, 4 l en 2 ml).
7. Lave las muestras durante 1 día como se describe en el paso 3.5, dejando el lavado final durante la noche.

4. Tinción nuclear

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Si no se requiere ninguna tinción nuclear o se requiere la longitud de onda de excitación/espectro de emisión de TO-PRO-3 para la excitación o detección de otro fluoróforo, omita este paso.

1. Diluir la mancha de ácido nucleico TO-PRO-3 a 1:1.000 en PTwH e incubar las muestras en 4 ml de solución de tinción nuclear durante 5 h.
2. Lave las muestras durante 1 día como se describe en el paso 3.5, dejando el lavado final durante la noche.
   NOTA: Después de los lavados, las muestras se pueden almacenar en PBS a 4 oC hasta la limpieza óptica.

5. Limpieza de tejidos

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Las muestras de tejido se deshidratan en una serie calificada de soluciones TBA. Como la inmunomancha requiere soluciones acuosas, todos los procedimientos de tinción deben terminarse antes de la limpieza del tejido. El aclaramiento óptico y la coincidencia del índice de refracción se logran mediante el tratamiento con una mezcla de BA, BB y DPE. La solución de limpieza se complementa con DL-o-tocoferol como antioxidante¹³.

1. Preparar soluciones TBA al 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% y 96% en agua destilada. Por ejemplo, para 30% TBA, añadir 15 ml de 100% TBA a 35 ml de agua destilada en un recipiente sellado relable adecuado y mezclar invirtiendo.
   NOTA: TBA tiene un punto de fusión de 25–26 oC; por lo tanto, tiende a ser sólido a temperatura ambiente. Para preparar las soluciones de TBA, caliente la botella bien sellada a 37 oC en una incubadora o baño de agua.
2. Deshidratar las muestras con 4 ml de cada concentración de la serie preparada de soluciones TBA en orden ascendente para 2 h cada una. Deje el 96% de TBA encendido durante la noche.
3. Deshidratar las muestras aún más en puro (100%) TBA durante 2 h.
4. Preparar la solución de compensación BABB-D15.
   NOTA: BABB-D15 es una combinación de BA y BB (BABB) que se mezcla con DPE en una relación de x:1, donde x se especifica en el nombre de la solución, en este caso 15.
   1. Para BABB, mezcle BA de una parte con dos partes BB.
   2. Mezclar BABB y DPE en una proporción de 15:1.
   3. Añadir 0,4 vol% DL-a-tocoferol (vitamina E).
      NOTA: Por ejemplo, para 20 mL de BABB-D15, mezclar 6,25 mL de BA con 12,5 mL de BB. Añadir 1,25 ml de DPE y complementarlo con 0,08 ml de DL-o-tocoferol.
5. Limpie las muestras en la solución de limpieza hasta que sean ópticamente transparentes (2-6 h).
6. Las muestras se pueden almacenar a 4oC en BABB-D15, protegidas de la luz, hasta el montaje y la toma de imágenes.

6. Montaje de muestras

1. Utilizando una impresora 3D, imprima la cámara de imágenes y la tapa (material: copoliéster [CPE], boquilla: 0,25 mm, altura de la capa: 0,06 mm, espesor de la pared: 0,88 mm, recuento de paredes: 4, relleno: 100%, sin estructura de soporte; el correspondiente . STL se puede encontrar en los Materiales Suplementarios de este protocolo).
2. Montar la cámara de imágenes (Figura2).
   1. Monte un soporte redondo (diámetro: 30 mm) en la cámara de imágenes con goma de silicona RTV-1 (de un componente de temperatura ambiente-vulcanizadora). Retire el exceso de caucho de silicona con un hisopo de algodón humedecido en agua y cure durante la noche.
   2. Montar un cubreobjetos redondo (diámetro: 22 mm) en la tapa con goma de silicona RTV-1. Retire el exceso de caucho de silicona con un hisopo de algodón humedecido en agua y cure durante la noche.
3. Coloque la muestra en una cámara de imágenes, agregue un pequeño volumen de BABB-D15 e inserte la tapa. Llene la cámara con BABB-D15 a través de la entrada, utilizando una aguja hipodérmica (27 G x 3/4 pulgadas [0,40 mm x 20 mm]).
4. Enchufe la entrada y selle la cámara de imágenes con goma de silicona RTV-1. Curar durante la noche en la oscuridad.

7. Procesamiento de imágenes y imágenes

1. Configure la adquisición de la imagen seleccionando las líneas láser respectivas para que coincidan con los fluoróforos utilizados. Ajuste los rangos de detección de cada detector para evitar la superposición de señal entre canales.
   NOTA: Los rangos de detección ejemplares para Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 y TO-PRO-3 son de 500 a 550 nm, 590–620 nm y 645–700 nm, respectivamente.
2. Elija los parámetros de adquisición, defina el borde superior e inferior de la pila z y adquiera la pila de imágenes.
   NOTA: Los parámetros de adquisición ejemplares son un escaneo secuencial con un tamaño de píxel de 60-90 nm, un tamaño de paso z de 0,5 m, un promedio de línea de 1, una velocidad de escaneo de 400 Hz y un tamaño de agujero de 1 unidad Airy.
3. Procesar la pila de imágenes utilizando el software de análisis de imágenes adecuado (por ejemplo, Fiji) para generar proyecciones 3D o realizar análisis en profundidad.
   NOTA: Debido al gran tamaño de los archivos de imagen adquiridos, normalmente es necesario el uso de una estación de trabajo.
   1. Abra los archivos de adquisición o de imagen en Fiji (Archivo ? Abiertos ? Seleccione archivos).
      1. Si utiliza, por ejemplo, . LIF, seleccione o anule la selección de las opciones deseadas en la ventana de diálogo Formatos biológicos. Ver pila con Hyperstack. Aparte de eso, no se necesarian selecciones o ticks específicos. Pulse OK.
      2. Si el archivo contiene varias pilas de imágenes, seleccione las que desea analizar y confirme pulsando OK.
   2. Realice la corrección de lejía dividiendo la imagen fusionada en canales individuales (Imagen ? Color ( Color ) Herramienta Canalesy, a continuación, seleccione Más . Dividir canales). Para cada canal, seleccione corrección de lejía (Imagen ? Ajustar ? Corrección de lejía) y elegir Simple Ratio (intensidad de fondo: 0.0).
      NOTA: En algunos casos, por ejemplo, cuando no hay decaimiento lineal de la señal o la señal es demasiado débil en general, Simple Ratio puede fallar. Alternativamente, pruebe Ajuste exponencial u omita la corrección de lejía.
   3. Ajuste el brillo y el contraste de cada canal con los controles deslizantes (Imagen ? Ajustar ? Brillo ? Contraste).
   4. Combinar los canales (Imagen ? Color ( Color ) Fusionar canales), hacer un compuesto (Imagen ? Color ( Color ) Herramienta Canalesy, a continuación, seleccione Más . Crear compuesto) y convertirlo a formato RGB (Imagen ? Color ( Color ) Herramienta Canalesy, a continuación, seleccione Más . Convertir a RGB).
   5. Si es necesario, cambie el tamaño de la pila de imágenes para reducir el tiempo de cálculo y el tamaño del archivo (Imagen ? Ajustar ? Tamaño, ambas opciones marcadas más interpolación bilineal).
   6. Generar una proyección 3D (Imagen ? Pilas ? Proyecto 3D). Elija Punto más brillante como método de proyección y establezca el espaciado de sector para que coincida con el tamaño del paso z de la pila de imágenes adquirida. Para obtener la máxima calidad, establezca el incremento del ángulo de rotación en 1 y habilite la interpolación. Modifique la rotación total, los umbrales de transparencia y la opacidad según sea necesario.
   7. Si es necesario, reajuste el contraste y el brillo convirtiendo la proyección 3D a formato de 8 bits (Imagen ? Tipo de la clase de texto (Type 8 bits). Utilice los controles deslizantes correspondientes (Imagen ? Ajustar ? Brillo ? Contraste) y reconvertir la pila de imágenes al formato RGB como se describe en el paso 7.3.4.
   8. Guarde la proyección 3D como . TIF (formato de archivo de imagen) y . AVI (formato de archivo de vídeo).

Resultados

La combinación de iDISCO¹⁴ y uDISCO¹³ junto con CLSM de alta resolución proporciona una visión profunda de la resolución espaciotemporal y la plasticidad de la infección RABV del tejido cerebral y el contexto celular circundante.

Mediante la inmunoutilización de la fosfoproteína RABV (P), se pueden visualizar capas complejas de células neuronales infectadas en secciones gruesas del cerebro del ratón (Figura3). Poster...

Discusión

El resurgimiento y desarrollo de técnicas de limpieza de tejidos en los últimos años^{2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bencílico	fuerte Alfa Aesar	41218	Reactivo
aclarado Benzoato de bencilo	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Reactivo de aclarante
Dimetilsulfóxido Carl	Roth	4720.2	Varios tampones Éter de
difenilo	Sigma-Aldrich	240834-100G	Reactivo de aclarado
DL-α-Tocoferol	Alfa Aesar	A17039	Suero antioxidante
burro	Bio-Rad	C06SBZ	Reactivo bloqueador
Glicina	Carl Roth	3908.2	Reducción de fondo
Suero de cabra	Merck	S26-100ML	Reactivo bloqueador
Heparina sal de sodio	Carl Roth	7692.1	Antecedentes reducción
Solución de peróxido de hidrógeno (30 %)	Carl Roth	8070.2	Blanqueo de muestras
Metanol	Carl Roth	4627.4	Pretratamiento
de muestras Paraformaldehído	Carl Roth	0335.3	Polvo cristalino para hacer solución fijadora
Azida de sodio	Carl Roth	K305.1	Prevención del crecimiento microbiano en soluciones madre
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Deshidratación de muestras para la limpieza de tejidos
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Tinción de ácido nucleico
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergente
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergente
Miscelánea
5 mL de reacción tubos	Eppendorf	0030119401	Tubos de muestra
Cubreobjetos, circular (diámetro: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Parte de la cámara de imagen
Cobertor, circular (diámetro: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Parte de la cámara de imagen
Aguja hipodérmica (27 G x & frac34; ” [0,40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Llenado de la cámara de imagen con solución de limpieza
RTV-1 caucho de silicona Wacker		Elastosil E43	Adhesivo para el montaje de la cámara de imagen
Ultimaker CPE 2,85 mm transparente	Ultimaker	8718836374869	filamento de copoliéster para impresora 3D para imprimir partes de la cámara de imagen
equipo técnico y software
Impresora 3D	Ultimaker	Ultimaker 2+	Impresión de la cámara de imagen Sistema automatizado
de inmersión en agua	Leica	15640019	Bomba de agua controlada por software
Agitador orbital de sobremesa	Elmi	DOS-20M	Incubación de muestras a temperatura ambiente (~ 150 rpm)Agitador
orbital de sobremesa, calefactado	New Brunswick Scientific	G24 Agitador ambiental	Incubación de muestras a 37 ° C (~ 150 rpm)
Microscopio de barrido láser confocal	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Microscopio confocal invertido para la adquisición de imágenes
de muestras Fiji	NIH (ImageJ)	software de código abierto (v1.52h)	Paquete de procesamiento de imágenes basado en ImageJ
Objetivo de inmersión en agua de larga distancia de trabajo	Leica 15506360		HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica VT1200S		Estación de
trabajo	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
strong>Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico anti-RABV N de cabra, generado por inmunización de cabra con nucleoproteína N de RABV expresada por baculovirus y purificada con His-tag Dilución: 1:400
anti-GFAP	Dako	Z0334	(RRID:AB_10013382) Dilución: 1:100
anti-MAP2 de conejo	Abcam	ab32454	(RRID:AB_776174) Dilución: 1:250
Anti-RABV de conejo P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico de conejo anti-RABV P, generado por inmunización de conejos con fosfoproteína P RABV expresada por baculovirus y purificada con His-tag (ver referencia 23: Orbanz et al., 2010) Dilución: 1:1.000
anticuerpos secundarios
		conjugados fluoróforo	Altamente absorbido cruzado Dilución: 1:500
Burro anti-ratón IgG	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500
Burro anti-conejo IgG	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Altamente absorbido cruzado Dilución: 1:500
Cabra anti-ratón IgG	Thermo Fisher Científico	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500
IgG anti-conejo de cabra	Thermo Fisher Scientific	en función del fluoróforo conjugado	Alta absorción cruzada Dilución: 1:500