Artículo de método

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

DOI:

10.3791/59413

⸱

17 de abril de 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

En este artículo

Resumen

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Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Resumen

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El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección de embriones de ratón y visualización de cámaras ventriculares embrionarias de ratón durante el desarrollo del corazón con ventrículo reportero fluorescente específico knock-en ratones (MLC-2v-tdTomato). Desarrollo del corazón consiste en una formación de tubo lineal de corazón, el tubo de corazón bucle y cuatro de cámara de tabicación. Estos complejos procesos son altamente conservados en todos los vertebrados. El corazón embrionario de ratón ha sido ampliamente utilizado para los estudios del desarrollo del corazón. Sin embargo, debido a su tamaño extremadamente pequeño, disección de corazón de embrión de ratón es un desafío técnico. Además, la visualización de la formación de la cámara cardiaca a menudo necesita hibridación in situ, beta-galactosidasa que manchaba usando ratones de reportero LacZ, o immunostaining del corazón embrionario seccionado. Aquí, describimos cómo diseccionar el corazón embrionario de ratón y visualizar directamente la formación de la Cámara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratones utilizando microscopía epifluorescente Monte todo. Con este método, es posible examinar directamente la formación del tubo corazón y bucle y 4 formación de la cámara sin más manipulación experimental de embriones de ratón. Aunque la línea de ratón knock-in de reportero de MLC-2v-tdTomato se utiliza en este protocolo como un ejemplo, este protocolo se puede aplicar a otras líneas de ratón transgénico de reportero fluorescente específica de corazón.

Introducción

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Formación de la cámara durante el desarrollo del corazón es un complejo proceso de transición a través de varias etapas embrionarias morfológicamente distintos1,2. La forma crescent de células progenitoras cardíacas de la población forma un tubo lineal corazón y entonces sufre alargamiento y colocación para formar la forma espiral del corazón en desarrollo. Después de su proceso de tabicación, pleno en desarrollo se transforma en el corazón de cuatro cámaras. Interrupción de cualquiera de estos procesos resulta en defectos del desarrollo del corazón. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos molecula....

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Protocolo

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Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de uso y Vanderbilt University Medical centro institucional Animal Care.

1. disección y colección de embriones de ratón

  1. Compañero de 8-10 semanas de edad hembra MLC-2v-tdTomato+- ratones con 8-10 semanas viejo MLC-2v-tdTomato+- ratones machos para obtener MLC-2v-tdTomato+ / +, MLC-2v-tdTomato+- y MLC-2v-tdTomato- / - embriones.
  2. Compruebe las presas para tapones vaginales todas las mañanas. Mediodía en el día de detección de enchufe vaginal se considera como E0.5.
    Nota: Examen Vaginal ....

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Resultados

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Durante el desarrollo del corazón, MLC-2v se considera ser el marcador más temprano para Cámara ventricular especificación17. Como se muestra en la figura 1, diseca el corazón embrionario de MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones y embriones todo ratón y examinado MLC-2v-tdTomato expresión de reportero durante el desarrollo del corazón. En MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones, expresión constitutiva tdTomato en pleno desarrol.......

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Discusión

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El método descrito aquí es relativamente simple examinar el desarrollo de la Cámara ventricular, sin realizar experimentos que requieren mucho trabajo para etiqueta proteínas o genes estructurales cardiacos específicos o ventriculares. Por lo tanto, este método reduce al mínimo la variabilidad técnica que se encuentra a menudo en las secciones de corazón immunostained.

Hay dos pasos fundamentales para realizar con éxito este método como estimación precisa de la edad embrionaria de ratones y di.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) y Gilead Sciences (Y.-J. programa de investigación N).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
microscopio de disecciónLeicaMZ125
escalera de ADN (100 pb)PromegaG2101
microscopio de disección de epifluorescenciaLeicaM165 FC
GoTaq Green master mix PromegaM712
Máquina de PCR (ciclador maestro)Eppendorf6336000023

Referencias

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  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
    3. ....

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Etiquetas

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