Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Resumen

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Resumen

Métodos actuales que utiliza habitualmente para cuantificar el mRNA en ovocitos y embriones incluyen la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa digital (dPCR), cuantitativo, en tiempo real RT-PCR (RT-qPCR) y la secuencia de RNA. Cuando estas técnicas se realizan con un solo óvulo o embrión, copia baja mRNAs no se detectan confiablemente. Para superar este problema, ovocitos o embriones pueden se agruparon para el análisis; sin embargo, esto conduce a menudo a la alta variabilidad entre las muestras. En este protocolo, describimos el uso de hibridación fluorescente in situ (FISH) usando química de DNA ramificado. Esta técnica identifica el patrón espacial de mRNAs en células individuales. Cuando la técnica es encontrar lugar y seguimiento informático, también puede cuantificar la abundancia de mRNAs en la célula. Usando esta técnica, hay menor variabilidad dentro de un grupo experimental y se requieren menos ovocitos y embriones para detectar diferencias significativas entre los grupos experimentales. Comercialmente disponible DNA ramificado SM-kits de peces han sido optimizados para detectar mRNAs en tejidos seccionados o células adherentes en diapositivas. Sin embargo, ovocitos no eficazmente a diapositivas y algunos reactivos en el kit eran demasiado duros, resultando en lisis de ovocitos. Para evitar esta lisis, se hicieron varias modificaciones al kit de pescado. Específicamente, buffers de permeabilización y lavado de ovocitos diseñadas para la inmunofluorescencia de oocitos y embriones reemplazados los almacenadores intermediarios del propietarios. La permeabilización, lavados e incubaciones con amplificador y puntas de prueba fueron realizadas en placas de 6 pocillos y ovocitos fueron colocados en portaobjetos en el extremo del protocolo utilizando medios de montaje. Estas modificaciones fueron capaces de superar las limitaciones del kit disponible comercialmente, en particular, la lisis de ovocitos. Precisa y reproducible, contar el número de los mRNAs de los ovocitos, se utilizó el software de computadora. Juntos, este protocolo representa una alternativa a la PCR y secuenciación para comparar la expresión de las transcripciones específicas en las células.

Introducción

Reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa (PCR) ha sido el estándar de oro para la cuantificación del mRNA. Actualmente se utilizan dos ensayos PCR (dPCR) digital¹ y cuantitativa, real time PCR (qPCR)² . De las dos técnicas PCR, dPCR tiene mayor sensibilidad que la qPCR sugiriendo que podría ser utilizado para medir la abundancia de ARNm en células individuales. Sin embargo, en nuestras manos, análisis de dPCR de mRNAs de baja abundancia en grupos de 5 a 10 ovocitos por cada muestra experimental ha producido datos con baja reproducibilidad y alta variación³. Esto es probablemente debi....

Protocolo

Procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la Universidad de Nebraska-Lincoln y todos los métodos fueron realizados conforme a las normas y directrices pertinentes. Para este estudio, CD-1 marginado ratones tuvieron acceso ad libitum a chow roedor normal y agua; se mantuvieron en un 12:12 oscuras: ciclo de luz.

1. preparación de medios necesarios

1. Para los medios de base (OMM), añadir 100 mM NaCl, KCl de 5 mM, 0,5 mM KH₂PO₄y 1,7 mM CaCl₂-2 H₂O a 100 mL de agua estéril.
   Nota: Medio OMM puede almacenarse hasta por 1 mes.

Resultados

Al finalizar el protocolo, el resultado es imágenes individuales de la serie z confocal (Figura 4A y figura 5), cosido de imágenes (figura 4), y mRNA cuenta (Figura 4B). Cuando se realiza la multiplexación, también habrá combinados imágenes que muestran la etiqueta de dos mRNAs diferentes (fi.......

Discusión

Una serie de pasos pequeños durante el protocolo asegurará de fluorescencia exitosa y precisa de mRNAs. En primer lugar, el protocolo debe realizarse inmediatamente después de recogida y fijación de los ovocitos. Tenga en cuenta que PVP se ha agregado el buffer de fijación de paraformaldehído al 4% para evitar que los ovocitos se pegue uno al otro. Encontramos que es necesario realizar el experimento inmediatamente después de la recogida y fijación de los ovocitos. Cualquier retraso se traduce en una mucho menor fluoresc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(±)-α-Ácido lipoico	Sigma-Aldrich	T1395	Ácido alfa lipoico
Albúmina, suero bovino, ácido graso	bajo MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10 ml Jeringa TB	Becton, Dickinson and Company 309659		jeringa de 10 ml
BD Aguja PrecisionGlide	Becton, Dickinson and Company 305109		Aguja de calibre 27 1/2
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma-Aldrich	C7902	CaCl2-2H2O
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C2404	Citrato
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G6152	Glucosa
Fosfato			Na2HPO4
Placa de Petri de fácil agarre	Falcon Corning	351008	Plato de 35 mm
Edetato Disódico	Avantor	8994-01	EDTA
Tijeras Bonn Extra Finas	Fine Science Tools	14084-08	Tijeras rectas, afiladas/afiladas, no dentadas, de 13 mm Suero
fetal bovino	biologicals	S10250	FBS
Solución de reactivo de gentamicina	gibco	15710-064	Gentamicina
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	Glutamax
Gold Seal Micro Portaobjetos	Gold Seal	3039	25 x 75mm
Gonadotropina, De Yeguas Preñadas Suero	Sigma	G4877	eCG
hCG recombinante	NHPP	AFP8456A	hCG
Hialuronidasa, Tipo IV-S: De Testículos Bovinos	Sigma-Aldrich	H3884	Hialuronidasa
Estilo Pinza de	Integra	17-305X	4-3/8", estilo 5F, Mandíbula Recta, Micro Fina L
-(+)-Ácido Láctico, ácido libre	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactato
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM Aminoácidos no esenciales	Corning	25-025-CL
Cubreobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0,15 mm Cubreobjetos
Mm-Nanog-O2-C2 Sonda de ARNsonda	diagnóstico celular avanzado 501891-C2		Sonda de nanog
mm-Pou5f1-O1-C3 Sonda de ARNsonda	diagnóstico celular avanzado 501611-C3		Sonda Pou5f1
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehído
PES 0.22 mmm Membrana estéril	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 Filtros de mmm
Polivinilpirrolidona	Sigma-Aldrich	P0930	PVP
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	60128	KCl
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	60218	KH2PO4
Reactivo antidecoloración Prolong Gold	invitrogen	P36934	Reactivo antidecoloración sin DAPI
RNAscope DAPI	Advanced Cell Diagnostics	320858	DAPI
RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2	Advanced Cell Diagnostics	320853	Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3	Advanced Diagnóstico celular	320854	Amplificador 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	Diagnóstico celular avanzado		Amplificador 320855 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	Diagnóstico celular avanzado Amplificador	320856	4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	Diagnóstico celular avanzado	320857	4 ALT C
RNAscope Kit de reactivos fluorescentes de detección multiplex	Diagnóstico celular avanzado	320851	kit de reactivos FISH Sonda
de RNAscope Sonda de control negativo de 3 plex	Diagnóstico celular avanzado 320871		Sonda
de control negativo de ARNscope Control positivo de 3 plex Control positivo	avanzado de	320881
Diluyente de sonda de ARNscope	Diagnóstico celular avanzado 300041		Diluyente de
sonda Diagnóstico celular avanzado de proteasa III		322337	proteasa
III Proteasa III & Kit de reactivos IV	Diagnóstico celular avanzado	322340	Kit de proteasa FISH
Proteasa de ARNscope IV Diagnóstico	celular avanzado	322336	Aguja de proteasa IV
S / S con Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	aguja roma de calibre 30
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S6297	NaHCO3
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S6191	NaCl
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	306576	NaOH
Piruvato de sodio, >= 99%	Sigma-Aldrich	P5280	piruvato
pocillos	Agtechinc	D18	Plato de 6 pocillos
Taurina	Sigma-Aldrich	T8691	Taurina
Plato de cultivo de tejidos Falcon	Corning	353002	plato de 60 mm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Triton X-100

disódico Atlanta joyería NEAA de de Amplificador Diagnóstico celular positivo ARNascopio de Solución de 6