El kit de diagnóstico de FL-DNA presentado es un método fácil de ahorrar tiempo y fácil de usar para determinar la probabilidad confiable de la presencia de lesiones por cáncer colorrectal.
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Artículo de método
Evaluación del riesgo y la prevalencia del cáncer colorrectal mediante la detección de la integridad del ADN de las heces
En este artículo
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Resumen
Resumen
Hoy en día, el ADN de las heces puede ser aislado y analizado por varios métodos. Los fragmentos largos de ADN en las heces pueden ser detectados por un ensayo qPCR, que proporciona una probabilidad confiable de la presencia de lesiones colorrectales pre-neoplásicas o neoplásicas. Este método, llamado ADN largo de fluorescencia (FL-DNA), es un procedimiento rápido y no invasivo que mejora el sistema de prevención primaria. Este método se basa en la evaluación de la integridad del ADN fecal mediante la amplificación cuantitativa de objetivos específicos del ADN genómico. En particular, la evaluación de fragmentos de ADN de más de 200 bp permite la detección de pacientes con lesiones colorrectales con muy alta especificidad. Sin embargo, este sistema y todas las pruebas de ADN de heces disponibles actualmente presentan algunas cuestiones generales que deben abordarse (por ejemplo, la frecuencia con la que se deben llevar a cabo las pruebas y el número óptimo de muestras de heces recogidas en cada punto de tiempo para cada individuo). Sin embargo, la principal ventaja de FL-DNA es la posibilidad de utilizarlo en asociación con una prueba utilizada actualmente en el programa de cribado de CRC, conocido como análisis de sangre oculta en heces basada en inmunoquímicos (iFOBT). De hecho, ambas pruebas se pueden realizar en la misma muestra, reduciendo los costos y logrando una mejor predicción de la presencia final de lesiones colorrectales.
Introducción
El cáncer colorrectal (CRC) deriva de un proceso de varios pasos en el que el epitelio sano se convierte lentamente en adenomas o pólipos, que progresan en carcinomas malignos con el tiempo1,,2. A pesar de la alta tasa de incidencia de la CRC, se ha observado una tendencia a la baja en el porcentaje de muertes en la última década3. De hecho, las herramientas de diagnóstico temprano adoptadas en los programas de cribado han llevado a la detección y eliminación temprana de adenomas pre-neoplásicos o pólipos4. Sin embargo, debido a los diferentes límites técnicos, n....
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Protocolo
Los pacientes fueron reclutados en el Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Italia) entre 2013 y 2015. Los pacientes inscritos estaban en el protocolo IRSTB002, aprobado por el Comité de ética del IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
1. Extracción de ADN de heces
- Utilice un kit para preparar muestras de heces (consulte Tabla de materiales). Seleccione y trate el material fecal realiz....
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Resultados
El flujo de trabajo de este protocolo se muestra en la figura 1. El flujo de trabajo proporciona dos pasos de control y acciones diferentes según estos resultados de paso. En primer lugar, si una muestra presenta controles inadecuados, la amplificación debe repetirse. En segundo lugar, si se inhibe la amplificación, la muestra debe ser reprocesada desde el principio o clasificada como no valiosa.
La Figura 2 muestra las curvas de fluorescencia producidas por m.......
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Discusión
Estudios anteriores han demostrado que el análisis de la integridad del ADN de las heces extraídas por enfoques manuales y semiautomáticos puede representar una herramienta alternativa para la detección temprana de lesiones colorrectales7,8,9,10,11,12. A lo largo de los años se han desarrollado pruebas de detección moleculare.......
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Divulgaciones
Maura Menghi es empleada a tiempo completo de Diatech Pharmacogenetics srl.
Agradecimientos
Los autores no tienen reconocimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 2 mL (sin inhibidores de DNasa, RNasa, ADN, PCR) | Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real | ||
| Etanol absoluto (calidad del grado analítico) | Reactivo necesario para la extracción de ADN | ||
| Centrífuga de sobremesa | Velocidad máxima de 20000 x g. Instrumento necesario para la extracción de ADN | ||
| Software de análisis EasyPGX versión 2.0.0 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | |
| Centrífuga/vórtice EasyPGX Tiras de 8 pocillos | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrumento recomendado para el ensayo de PCR en tiempo real |
| EasyPGX qPCR instrument 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrumento recomendado para el ensayo de PCR en tiempo real |
| Preparado para EasyPGX FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Kit necesario para el ensayo de PCR en tiempo real |
| Micropipetas (volúmenes de 1 a 1.000 y micro; L) | Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real | ||
| Guantes | Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Kit recomendado para la extracción y purificación de ADN de las heces |
| Puntas de filtro estériles DNasa-, RNasa (volúmenes de 1 a 1.000 y micro; L) | Consumibles necesarios para la extracción de ADN y PCR en tiempo real | ||
| Bloque térmico, por ejemplo, bloque seco EasyPGX | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Instrumento necesario para la extracción de ADN |
| Vórtice, por ejemplo, centrífuga/vórtice EasyPGX 1,5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrumento necesario para la extracción de ADN |
Referencias
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
