Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

Yuyang Wang; Weidi Xu; Huancheng Guo; Wenjie Gong; Biao He; Zhongzhong Tu; Changchun Tu; Ye Feng

doi:10.3791/59428

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Artículo de método

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

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DOI:

10.3791/59428

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2 de mayo de 2019

Yuyang Wang^*¹ , Weidi Xu^*¹^,² , Huancheng Guo¹ , Wenjie Gong¹ , Biao He¹ , Zhongzhong Tu¹ , Changchun Tu¹^,³ , Ye Feng¹

¹Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control, Institute of Military Veterinary Medicine, Academy of Military Medical Sciences, ²Jilin Agricultural University, ³Jiangsu Co-innovation Centre for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.

Resumen

Para detectar el virus de la rabia y otras especies miembro del género lyssavirus dentro de la familia rhabdoviridae, se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada de pan-lyssavirus (RT-PCR anidada) para detectar la región conservada del gen de la nucleoproteína (N) de los lissavirus. El método aplica la transcripción inversa (RT) utilizando ARN viral como plantilla y oligo (DT)₁₅ y hexámeros tal aleatorios como imprimadores para sintetizar el ADN complementario viral (cDNA). Luego, el cDNA viral se utiliza como una plantilla para amplificar un fragmento de gen 845 BP N en PCR de primera ronda usando imprimadores externos, seguidos por PCR anidada de segunda ronda para amplificar el fragmento final de 371 BP usando imprimadores internos. Este método puede detectar diferentes clados genéticas de virus de la rabia (RABV). La validación, utilizando 9.624 especímenes de cerebro de ocho especies de animales domésticos en 10 años de diagnósticos clínicos de rabia y vigilancia en China, demostró que el método tiene 100% de sensibilidad y 99,97% de especificidad en comparación con la fluorescente directa prueba de anticuerpos (FAT), el método estándar de oro recomendado por la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Organización Mundial de sanidad animal (OIE). Además, el método también podría amplificar específicamente el fragmento genético N objetivo de otras 15 especies aprobadas y dos novelas de lyssavirus en el 10º informe del Comité Internacional sobre taxonomía de virus (ICTV), evaluado por una detección mímica de N plásmidos génicos de todos los lyssaviruses. El método proporciona una alternativa conveniente a FAT para el diagnóstico de la rabia y ha sido aprobado como una norma nacional (GB/T36789-2018) de China.

Introducción

La rabia es una enfermedad zoonótica mundial causada por virus en el género lyssavirus¹. Los lyssavirus (familia rhabdoviridae) son virus de ARN de cadena única negativa con un genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) y la proteína grande o polimerasa (L). Basándose en secuencias de nucleótidos del gen N, la distancia genética y los patrones antigénicos, los lissavirus se han dividido en 16 especies, que comprenden el virus de la rabia clásica (RABV) y los virus relacionados con la rabia (RRV): virus del murciélago de lagos (LBV), virus de Duv....