Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.
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Artículo de método
Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC
En este artículo
Resumen
Resumen
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular progresiva grave causada por mutaciones en el gen de la distrofina, que en última instancia conduce al agotamiento de las células progenitoras musculares. La edición de genes 9 (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada tiene el potencial de restaurar la expresión del gen de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de células madre (iPSC) derivadas de células anticuarias derivadas de la ínloga (IPSC) pueden reponer la agrupación de células madre/progenitoras, reparar el daño y prevenir más complicaciones en dMD sin causar una respuesta inmunitaria. En este estudio, introducimos una combinación de tecnologías CRISPR/Cas9 y iPSC no integradas para obtener progenitores musculares con expresión de proteína de distrofina recuperada. Brevemente, utilizamos un vector Sendai no integrador para establecer una línea iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx. A continuación, utilizamos la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de la distrofina a través de una unión final no homóloga del gen de la distrofina reenmarcada. Después de la validación de PCR de agotamiento de exon23 en tres colonias de 94 colonias iPSC escogidas, diferenciamos iPSC en MPC por expresión de MyoD inducida por doxiciclina (Dox), un factor de transcripción clave que desempeña un papel significativo en la regulación de la diferenciación muscular. Nuestros resultados muestran la viabilidad de utilizar la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en MPC derivado de iPSC, que tiene un potencial significativo para desarrollar terapias futuras para el tratamiento de la DMD.
Introducción
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las distrofias musculares más comunes y se caracteriza por la ausencia de distrofina, afectando a 1 de aproximadamente 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo1. La pérdida de la función del gen de la distrofina da lugar a defectos musculares estructurales que conducen a la degeneración progresiva de las miofibras1,2. Se ha probado el sistema de terapia génica mediado por el virus adeno asociado recombinante (rAAV) para restaurar la expresión de la distrofina y mejorar la función muscular, como el reemplazo de genes mediante microdist....
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Protocolo
Todos los procedimientos quirúrgicos y de manejo de animales fueron realizados por un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Augusta (IACUC). Los ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.
1. Aislamiento de fibroblastos primarios de ratón de ratones Dmdmdx adultos
- Euthanizar adultodmdx ratones (masculino, 2 meses de edad) por asfixia deCO2 y toracotomía según IACUC aprobado por el Colegio Médico de Georgia, Universidad Augusta. Cortar la cola con un bisturí estéril en una condición estéril bajo la campana laminar. Enjua....
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Resultados
Establecimiento de fibroblastos cutáneos Dmdmdx derivados de iPSC. Demostramos la eficiencia de generar iPSCs de ratón a partir de ratones Dmdmdx derivados de fibroblastos cutáneo utilizando los vectores de reprogramación sin integración. La Figura 1A demostró que la aparición de colonias similares a células madre embrionarias (ESC) a las tres semanas después de la infección. Evaluamos la eficiencia de la inducción de iPSC por mancha de fosfat.......
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Discusión
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad hereditaria destructiva y, en última instancia, mortal caracterizada por la falta de distrofina, lo que conduce a la atrofia muscular progresiva1,2. Nuestros resultados demuestran la expresión del gen de la distrofina restaurada en las células progenitoras miogénicas derivadas de Dmdmdx iPSC mediante el enfoque de la eliminación del exón23 mediado por CRISPR/Cas9. Este enfoque tiene tres ventaja.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Tang y Weintraub fueron parcialmente compatibles con NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instrumentos | |||
| aguja de calibre 31 | Varios | ||
| Incisión afilada | varios | ||
| Bisturíes estériles | varios | ||
| Pinzas | Varios | ||
| Medio fibroblasto (para 100 mL de medio completo)Número de | catálogo | la empresa | Volumen |
| 2-Mercaptoetanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0,1 mL |
| Antibiótico Antimicótico Escoria 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - glucosa alta | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Suero Bovino Caracterizado | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamina solución | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| Solución TVP (para 500 mL de solución completa) | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| Suero de pollo | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Solución | a 500 mL | ||
| Tripsina (2,5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES medio de crecimiento (para 500 mL de solución completa)Número de catálogo de | la empresa | Volumen | |
| 2-Mercaptoetanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0,5 mL |
| Antibiótico Antimicótico Escoria 100x | MT30004CI | 5 mL | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medio - glucosa alta | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Suero fetal bovino Caracterizado | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamina solución | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Factor inhibidor de leucemia (LIF) recombinante de ratón, 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μ L |
| Suplemento Inhibidor de MEK/GS3 EMD | Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μ L |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| Los medios de células madre embrionarias no deben almacenarse durante más de 4 semanas y con inhibidores no más de 2 semanas. | |||
| mES medio congelado (para 50 mL de solución completa) | >Empresa | >Número de catálogo | Volumen |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - alta glucosa | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Suero Fetal Bovino Caracterizado | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) recombinante de ratón, 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μ L |
| Nombre del material/equipo Número de catálogo de | la empresa | RRID | |
| 0,05% Tripsina/0,53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehído | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Solución de accutasa | SIGMA | A6964 | Solución de desprendimiento de células |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Anticuerpo anti-ratón conjugado con Alexa488 | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa488 | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-anticuerpo conjugado contra el conejo | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Actina muscular (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Distrofina | Thermo | PA5-32388 | |
| AB_2549858 anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | |
| AB_11217637 anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1 (MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Fosfatasa alcalina Tinción viva (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidina S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillina | Millipore | 205805-250MG | |
| Colagenasa IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Células Competentes | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramación | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Reactivo de lisis (celda) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispasa (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Clorhidrato de doxiciclina | Bioreactivos Fisher BP26535 | ||
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectina plasma bovino | SIGMA | F1141 | |
| Kit de extracción de gel QIAEX II (500) | QIAGEN | 20051 | |
| Gelatina de piel porcina, tipo A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Medio de montaje antidecoloración con DAPI | Vector | H-1500 | |
| Higromicina B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamina Inyección de HCL | SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 ratón MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| ratón sobre ratón (M.O.M.) Kit Básico | Vector BMK-2202 | ||
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Medios de suero | reducidos ThermoFisher | 31985070 | |
| Polietilenglicol 4.000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lisina/Laminina Portaobjetos | de cultivo CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Mezcla maestra verde | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premezcla | TakaRa | R045 | |
| Proteinasa K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Dihidrocloruro de puromicina | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| lentivirus qPCR Kit de valoración | abm | LV900 | |
| Kit de ligadura rápida | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Kit de transcripción inversa | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Centro de Investigación Molecular, INC | RN 190 | |
| T4 T4 Tampón de reacción de ADN ligasa | NEB | B0202S | |
| T4 Polinucleótido quinasa | NEB | M0201S | |
| Excelente caldo modificado | Fisher BioReactivos | BP9729-600 | |
| Reactivo ViralBoost (500x) | ALSTEM | VB100 |
Referencias
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss cause....
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Reimpresiones y permisos
