Artículo de método

Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

7.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 de septiembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.

Resumen

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular progresiva grave causada por mutaciones en el gen de la distrofina, que en última instancia conduce al agotamiento de las células progenitoras musculares. La edición de genes 9 (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada tiene el potencial de restaurar la expresión del gen de la distrofina. Las células progenitoras musculares derivadas de células madre (iPSC) derivadas de células anticuarias derivadas de la ínloga (IPSC) pueden reponer la agrupación de células madre/progenitoras, reparar el daño y prevenir más complicaciones en dMD sin causar una respuesta inmunitaria. En este estudio, introducimos una combinación de tecnologías CRISPR/Cas9 y iPSC no integradas para obtener progenitores musculares con expresión de proteína de distrofina recuperada. Brevemente, utilizamos un vector Sendai no integrador para establecer una línea iPSC a partir de fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx. A continuación, utilizamos la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de la distrofina a través de una unión final no homóloga del gen de la distrofina reenmarcada. Después de la validación de PCR de agotamiento de exon23 en tres colonias de 94 colonias iPSC escogidas, diferenciamos iPSC en MPC por expresión de MyoD inducida por doxiciclina (Dox), un factor de transcripción clave que desempeña un papel significativo en la regulación de la diferenciación muscular. Nuestros resultados muestran la viabilidad de utilizar la estrategia de eliminación de CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en MPC derivado de iPSC, que tiene un potencial significativo para desarrollar terapias futuras para el tratamiento de la DMD.

Introducción

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las distrofias musculares más comunes y se caracteriza por la ausencia de distrofina, afectando a 1 de aproximadamente 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo1. La pérdida de la función del gen de la distrofina da lugar a defectos musculares estructurales que conducen a la degeneración progresiva de las miofibras1,2. Se ha probado el sistema de terapia génica mediado por el virus adeno asociado recombinante (rAAV) para restaurar la expresión de la distrofina y mejorar la función muscular, como el reemplazo de genes mediante microdistrophins(-Dys). Sin embargo, el enfoque de rAAV requiere inyecciones repetidas para sostener la expresión de la proteína funcional3,4. Por lo tanto, necesitamos una estrategia que pueda proporcionar de manera efectiva y permanente la expresión génica de la distrofina en pacientes con DMD. El ratón Dmdmdx, un modelo de ratón para DMD, tiene una mutación puntual en el exón 23 del gen de la distrofina que introduce un codón de terminación prematura y da como resultado una proteína truncada no funcional que carece del dominio de unión de distroglicano C-terminal. Estudios recientes demostraron el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para restaurar la expresión del gen de la distrofina mediante una corrección génica precisa o la eliminación de exón mutante en animales pequeños y grandes5,6,7. 8 informaron del método para corregir la mutación del gen de la distrofina en la línea germinal del ratón Dmdmdx por reparación dirigida por homología (HDR) basada en la edición del genoma CRISPR/Cas9. 9informaron que el rAAV podría extirpar eficientemente el exón 23 mutante en ratones distróficos. En estos estudios, los gRNA fueron diseñados en los intrones 20 y 23 para causar roturas de ADN de doble cadena, que restauraron parcialmente la expresión de distrofina después de la reparación del ADN a través de la unión final no homóloga (NHEJ). 10 recientemente informaron de la eficacia y viabilidad de la edición de genes CRISPR mediada por rAAV en la restauración de la expresión de distrofina en modelos caninos, un paso esencial en la aplicación clínica futura.

DMD también causa trastornos de las células madre11. Para el daño muscular, las células madre musculares residenciales reponen las células musculares moribundas después de la diferenciación muscular. Sin embargo, los ciclos consecutivos de lesión y reparación conducen a la acortación de telómeros en las células madre musculares12,y el agotamiento prematuro de las agrupaciones de células madre13,14. Por lo tanto, una combinación de terapia de células madre autóloga con edición del genoma para restaurar la expresión de la distrofina puede ser un enfoque práctico para el tratamiento de la DMD. La tecnología CRISPR/Cas9 ofrece la posibilidad de generar células madre pluripotentes inducidas genéticamente autodescriptivas (iPSC) para la regeneración muscular funcional y prevenir más complicaciones de DMD sin causar rechazo inmune. Sin embargo, los ISPC tienen un riesgo de formación de tumores, que podría aliviarse mediante la diferenciación de iPSC en células progenitoras miogénicas.

En este protocolo, describimos el uso del virus Sendai no integrador para reprogramar fibroblastos dérmicos de ratones Dmdmdx en isPC y luego recuperar la expresión de distrofina mediante la eliminación del genoma CRISPR/Cas9. Después de la validación de la eliminación de Exon23 en iPSC por genotipado, diferencimos el iPSC corregido por genoma en progenitores miogénicos (MPC) a través de la diferenciación miogénica inducida por MyoD.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos y de manejo de animales fueron realizados por un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Augusta (IACUC). Los ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.

1. Aislamiento de fibroblastos primarios de ratón de ratones Dmdmdx adultos

  1. Euthanizar adultodmdx ratones (masculino, 2 meses de edad) por asfixia deCO2 y toracotomía según IACUC aprobado por el Colegio Médico de Georgia, Universidad Augusta. Cortar la cola con un bisturí estéril en una condición estéril bajo la campana laminar. Enjuague la cola con 70% de etanol durante 5 min y luego lave con solución salina estéril con fosfato (PBS) en un plato de 6 cm.
  2. Pelar la piel de la cola por una incisión aguda desde la base hasta la punta de la cola a lo largo de la piel de la cola, y luego pelar suavemente la piel de la cola con pinzas. Mince la piel a un tamaño de 1 mm3 usando un bisturí estéril y mueva el tejido de la piel picada a un plato de 6 cm en el medio esencial mínimo de Dulbecco/F12 de Ham (DMEM/F12) que contiene 0.1% colagenasa IV y 1 U/ml de dispase.
  3. Digerir el tejido cutáneo en un plato de cultivo durante 2 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
  4. Recubrir una placa de 6 pocillos con fibronectina y 0,2% de gelatina (1 ml de fibronectina en 199 ml de 0,2% de gelatina; Tabla de Materiales) e incubar a 37oC durante 1 h.
  5. Disociar el tejido cutáneo digerido con una punta de pipeta de 1 ml y transferir el tejido y el sobrenadante a un tubo de centrífuga cónica estéril de 15 ml. Centrifugar a 217 x g durante 3 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1,5 ml de medio defibroblastos (Tabla de materiales).
  6. Cultivo de los pellets incluyendo tejido cutáneo digerido incompleto del paso 1.5 en la placa de 6 pocillos recubierto con fibronectina y 0.2% gelatina del paso 1.4 en una incubadora de 37oC, 5% CO2. Reemplace el medio 24 h después del revestimiento inicial para eliminar las celdas no conectadas y cambie el medio cada 48 h.

2. Reprogramar fibroblastos de la piel del ratón en iPSCs

  1. Dos días antes de la transducción, digerir los fibroblastos dérmicos del ratón del paso 1.6 con la solución de desprendimiento celular(Tabla de Materiales)en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada de 5%CO2 durante 5 min.
  2. Cuente las células usando un hemacitómetro y centrífuga a 217 x g durante 3 min.
  3. Células de semillas a una densidad de 1 x 2 x 105 células por pocido sobre una placa de 6 pocillos y cultivo con medio defibroblastos (Tabla de materiales)en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% de CO2.
  4. El día de la transducción (día 0), estime las células y calcule el volumen de cada virus necesario para alcanzar la multiplicidad objetivo de infección (MOI) de 5, 5 y 3 (es decir, KOS MOI 5, hc-Myc MOI a 5, hKlf4 MOI a 3) de acuerdo con el manual comercial.

figure-protocol-1

  1. Descongelar tres tubos Sendai en un baño de agua de 37oC durante 5 o 10 s y añadir los volúmenes calculados de cada uno de los tres tubos Sendai a 1 ml de medio defibroblastos (Tabla de materiales).
  2. Retire el medio fibroblasto del paso 2.3 y agregue la mezcla de virus de reprogramación a los pozos que contienen las células. Incubar las células durante la noche en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
  3. Sustituya el medio por un fibroblasto fresco medio de 24 horas después de la transducción. Cultivo de las células durante una semana con intercambio medio cada dos días.
  4. Cosecha fibroblastos de ratón infectados el día 7 después de la transducción con 0.05% trypsin/EDTA y colocar en platos previamente recubiertos con fibronectina y 0.2% gelatina.
  5. Cultivo de los fibroblastos de ratón infectados del paso 2.6 con medio de crecimiento completo de células madre embrionarias de ratón (ES)(Tabla de materiales)en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5% CO2 y cambio de medio diario.
  6. A partir del octavo día, observe la placa bajo un microscopio invertido cada dos días para identificar la apariencia de los grumos celulares con la morfología de la ES del ratón.

3. Uso de la mancha viva de fosfatasa alcalina y citometría de flujo para cuantificar la eficiencia de reprogramación

  1. Retire los medios de cultivo de cada poca y enjuague con DMEM/F-12 durante 2 x 3 min.
  2. Aplicar 2 ml de 1 x solución de trabajo de manchas de fosfatasa alcalina (AP) vivo (1:500 dilución en DMEM/F-12) a las células adherentes, e incubar en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5% CO2 durante 30 min.
  3. Aspirar la mancha viva AP y lavar dos veces con PBS para 5 min cada uno.
  4. Digerir las células con la solución de desprendimiento celular(Tabla de Materiales)en una incubadora de 37 oC con una atmósfera humidificada de 5%CO2 durante 5 min. Realizar citometría de flujo para determinar la eficiencia de reprogramación.

4. Selección y cosecha de células similares a ES

  1. Examine las colonias del paso 2.8 bajo un microscopio invertido.
  2. Marque las colonias en la parte inferior del plato con un marcador de objeto autoentintado.
  3. Aplique anillos de clonación engrasados para cubrir las colonias celulares marcadas. Añadir 100 sl de tripina/EDTA al 0,05% de trippsina/EDTA a cada anillo de clonación a 37 oC durante 5 min, y luego transferir las células digeridas con puntas de pipeta de 100 l a placas de cultivo de 48 pocillos que contienen medio de crecimiento mES.
  4. Incubar las células en placas de cultivo de 48 pocillos en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% deCO2. Pasar las células a 6 cm de plato cuando alcancen 70% de confluencia.
  5. Repita los pasos 4.3 y 4.4 varias veces hasta obtener clones uniformes en forma de dormitorio.

5. Congelación de iPSCs para criopreservación

  1. Disociar los iPSC seleccionados del paso 4.5 con trippsina, versene y plasma de polluelo (TVP; Tabla de Materiales) solución a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5% durante 30 min.
  2. Recoger las células en un tubo cónico estéril de 15 ml y centrifugar a 217 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  3. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 2 ml de medio congelado ES de ratón(Tabla de Materiales)para obtener 1 ml por criovial.
  4. Agregue las células a los crioviales y congele con un recipiente congelador que proporcione la velocidad de enfriamiento crítica y repetida de -1 oC/min necesaria para la criopreservación a -80 oC durante la noche.
  5. Transfiera los viales congelados a un tanque de nitrógeno líquido.

6. Tinción de inmunofluorescencia para marcadores de células madre en isPC

  1. IPSCs de semillas del paso 5.1 cultivadas con medio mES en un portaobjetos de cámara de 8 polos recubierto con poli-D-lisina/laminina(Tabla de Materiales)a la densidad adecuada para lograr entre 1 x 2 x 104 células por pocto e incubar en una incubadora de 37 oC con una ambiente humidificado del 5% deCO2 durante 48 h.
  2. Sumerja las diapositivas en un 4% de formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego sumerja las diapositivas en PBS dos veces durante 5 minutos cada vez.
  3. Incubar secciones con un reactivo de bloqueo de IgG de ratón(Tabla de Materiales)y un 5% de suero de cabra durante 1 h a temperatura ambiente.
  4. Diluir los anticuerpos primarios en diluyente proteico (ratón-anti-SSEA1, 1:100, conejo-anti-Nanog, 1:500; conejo-anti-POU clase 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; conejo-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; conejo-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400 Materiales). Aplicar anticuerpos sobre las células e incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
  5. Deseche la solución primaria de anticuerpos y lave los portaobjetos 3x en PBS.
  6. Aplique segundos anticuerpos (anticuerpo de cabra antiratón conjugado conAlexa488 y Alexa555 conjugado de cabra-anticonejo, 1:400 cada uno) en diluyente proteico M.O.M. en portaobjetos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  7. Lave las diapositivas 3x en PBS y monte secciones con medio de montaje que contenga 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  8. Tome fotografías con un microscopio confocal.

7. Investigar la pluripotencia de los iPSC in vivo

  1. Disociar los iPSC del paso 5.1 en células individuales utilizando la solución TVP en una incubadora de 37oC con una atmósfera humidificada del 5% de CO2 durante 30 min.
  2. Cuente las células usando un hemacitómetro y centrífuga a 217 x g durante 3 min.
  3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con medio mES en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml a una concentración de 5 x 105 células/30 l para el trasplante de células.
  4. Retire el vello de ambas extremidades posteriores de ratones inmunodeficientes usando cortapelos.
  5. Anestetiza ratones con ketamina (100 mg/kg) y limpia el lugar de inyección con 75% de alcohol.
  6. Inyectar 30 s de suspensión de iPSC desde el paso 7.3 por vía intramuscular en el gastrocnemii, utilizando una aguja de 31 G.
  7. Dos semanas después de la inyección, cosechar el ratón gastrocnemii e incrustar en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), congelar y cortar en secciones de 5-m15,16.
  8. Arreglar secciones en 4% formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego lavar los portaobjetos dos veces en PBS durante 5 min cada vez.
  9. Bloquear las células con un diluyente de proteína sérica de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
  10. Añadir anticuerpo primario diluido (conejo anti-AFP, 1:50; conejo anti-SMA, 1:50; conejo anti-TH, 1:50) a los toboganes e incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
  11. Deseche la solución primaria de anticuerpos, lave las células 3x (5 min/lavado) en PBS, agregue un anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con 1:400 diluido Alexa555 a diapositivas e incubar durante 45 min a temperatura ambiente.
  12. Lave los portaobjetos 3x (5 min/lavado) en PBS, y monte las secciones con medio de montaje que contenga DAPI.

8. Construcción de vectores lentivirales CRISPR/Cas9 dirigidos a intrones que flanquean el exón de distrofina 23

  1. Diseñar dos pares de oligos gRNA dirigidos a exón 23 de distrofina flanqueado por intron a través de http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    NOTA: Los pares diseñados son los siguientes:
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
    i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
  2. Digestylate 5 g de plásmido CRISPR lentiviral (lenti-CRISPRv2-blast [un regalo de Mohan Babu] y lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un regalo de Kristen Brennand])(Tabla de Materiales)con BsmB1/Esp3I durante 30 min a 37oC. Para 5 g de plásmidos, añadir 3 l de enzima de restricción BsmB1, 3 l de fosfatasa alcalina rápida, 6 ml de tampón de digestión enzimática 10x y 0,6 ml de TDT de 100 mM en reacción de 60 ml).
  3. Cargue las reacciones en un gel de agarosa del 0,8%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
  4. Purificar el plásmido digerido en gel utilizando un kit de extracción de gel(Tabla de Materiales)y eluir en 20 oL de H2O.
  5. Fosforilato y recocido cada par de oligonucleótidos gRNA que contienen 1 l de cada oligonucleótido a 100 m, 1 l de tampón de ligadura 10x T4, 0,5 ml de polinucleótido quinasa T4 (PNK), 6,5 ml de ddH 2 O a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótidos quinasa (PNK), 6,5 oC de ddH 2 O a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 OC a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 O C a 37 oC durante 30 min, y luego 95 oC de polinucleótido quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH 2 O C a 37 oC durante 30 minutos, y luego 95 oC de polinucleótidos quinasa (PNK), 6,5 oL de ddH2O C a 37 oC durante 30 minutos, y luego 9 propiedad a 25 oC a 5 oC/min.
  6. Ligar una dilución 1:200 de los oligonucleótidos gRNA recocidos en el plentiCRISPR V2-Blast o plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mezclar 50 ng de vectores digeridos BsmB1/Esp3I con 1 l de dúplex oligo diluido y 5 l de tampón de ligasa de 2x más 1 l de ligasa en un sistema de reacción de 11 l e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  7. Realizar la transformación con 3 l de producto de ligadura en celdas competentes de 50 l(Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  8. Esparcir las células competentes transformadas en una placa de agar con 100 g/ml de carbenicilina e incubar a 31,5 oC durante 18 h.
  9. Escoja colonias con puntas de pipeta estériles de 10 ol y cultivo en 5 ml de caldo estupendo(Tabla de Materiales)que contenga 100 g/ml de carbenicilina a 31,5 oC, 185 rpm en una incubadora de coctelera durante 21 h.
  10. Purifica el ADN plásmido usando los kits de mini-preparación y midi-prep(Tabla de Materiales).
  11. Verifique los plásmidos de mini-preparación mediante la digestión de restricción. Para el sistema de reacción de 20 l, añadir 1 g de ADN plásmido, 2 l de tampón de reacción de digerida(Tabla de materiales)y 1 l de mezcla de enzimas de restricción (0,5 l de KpnI-HF y 0,5 l de AgeI-HF para abundanteCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 l de NotI-HF y 0,5 l de EcoRI-HF para plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 ?L de NotI-HF y 0,5 l de EcoRI-HF para plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incubar el sistema de reacción durante 1 h a 37oC.
  12. Cargue las reacciones en un gel de agarosa del 0,8%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
    NOTA: Las bandas correctas para plentiCRISPR V2-Blast-i22 deben ser de 622 bp y 12,2 kb, y las bandas correctas para plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 deben ser de 2,6 kb y 7,1 kb.

9. Embalaje vectorial lentiviral

  1. Cultivo 7 x 105 293FT células en 5 mL de medios DMEM que contienen 10% de suero bovino fetal en un plato de 6 cm durante la noche a 37 oC, 5% CO2.
  2. Preparar un cóctel (1 g de plentiCRISPR V2-Blast-i22 o plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng de plásmido de envase psPAX2, 250 ng de plásmido de sobre pMD2.G y 5 l de reactivo de transfección A [Tabla de materiales] en 100 ol de suero reducido MEM).
  3. Preparar una mezcla de 5 ml de reactivo de transfección B(Tabla de materiales)en 100 ml de medios MEM séricos reducidos.
  4. Añadir 100 ml de mezcla B del reactivo de transfección a la mezcla de plásmido del paso 9.2 e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Agregue el complejo de lípidos de ADN (del paso 9.4) con gota a las células 293FT. Incubar durante la noche a 37oC con 5% deCO2.
  6. Añadir potenciador de la producción de virus (500x)(Tabla de materiales)a cada plato al día siguiente e incubar durante 24 h a 37 oC, 5% CO2.
  7. Recoja el medio de las células usando pipetas en los próximos dos días y filtre el medio a través de un filtro de 0,45 m para eliminar las células.

10. Concentración y purificación de vectores lentivirales

  1. Precipitar el vector lentiviral en el medio del paso 9,7 durante la noche a 4oC con 5x polietilenglicol 4000 (PEG4000, 8,5% de concentración final) y 4 M de NaCl (0,4 M de concentración final).
  2. Centrifugar los medios virales que contienen la solución PEG4000 a 2.095 x g y 4 oC durante 30 min, retirar y desechar el sobrenadante.
  3. Resuspender los gránulos con 500 ml de medios MEM reducidos en suero (titer de lentivirus: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2-control: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-control: 5.9 x70 ). Conservar a -80oC hasta su uso.

11. Eliminación del exón 23 en iPSCs de ratón con dos ARN guía (gRNAs) junto con Cas9

  1. Placar los iPSCs del ratón desde el paso 4.5 en una placa de 24 pocillos recubierta con fibronectina y gelatina.
  2. Después de que las células alcancen una confluencia del 50%, cambie al medio de cultivo fresco (medio completo de crecimiento de células madre embrionarias de ratón) que contiene 8 g/ml de polibreno).
  3. Añadir 100 l de la solución de partículas lentivirales desde el paso 10.3, incluyendo lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 y control (vector vacío: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) a iPSCs de ratón. Incubar células durante 3 días a 37oC con 5% deCO2.
  4. Seleccione células infectadas de forma estable con medios que contengan blasticidina de 2,5 g/ml y higromicina B de 100 g/ml determinando la concentración mínima de blasticidina e higromicina B necesaria para matar la célula no infectada.
    NOTA: Las células no infectadas morirían por blasticidina e higromicina B.
  5. Digerir los iPSCs de ratón seleccionados con 0,5 ml de solución TVP cada poca (placa de 24 pocillos) e incubar celdas durante 30 min a 37 oC con un 5% de CO2.
  6. Disociar los IPSC en células individuales pipeteando, contar las células con una cámara de recuento celular y luego diluir alrededor de 150 células individuales digeridas con medio mES en plato de 10 cm para cultivo a 37 oC con 5% de CO2.
  7. Después de unos 10 días, recoger colonias individuales bajo un microscopio invertido usando puntas de pipeta estéril de 10 l (96 colonias necesitan ser recogidas).
  8. Transfiera las colonias escogidas a 50 l de solución tvP cada pocillo (placa de 96 pocillos, una colonia cada pocillo), digiere a 37 oC durante 30 minutos y luego siembre las células digeridas en dos placas de cultivo de 96 pocillos para mantener el cultivo (uno para el genotipado).
  9. Incubar en una incubadora de CO2 a 37oC hasta un 70% de confluente.

12. Identificación de colonias iPSC con eliminación de exón23

  1. Retire el medio en la placa de 96 pocillos cuando las colonias celulares alcancen el 70% de confluencia.
  2. Añadir 25 l de reactivo de lisis(Tabla de materiales)que contenga solución de proteinasa K (1 ml de proteinasa K en 100 ml de reactivo de lisis) a cada pocil, y transferir el lisado a una placa PCR de 96 pocillos.
  3. Sellar la placa pcR e incubar las placas a 55 oC durante 30 min, y luego a 95 oC durante 45 minutos para cargar las células y desnaturalizar la proteinasa K.
  4. Llevar a cabo la reacción de PCR con 2 l de lisato desde el paso 12.3. Para la reacción de PCR de 20 l, añadir 2 l de lisato, 10 l de premezcla de polimerasa de ADN 2x(Tabla de materiales),7 l de agua libre de DNase y 1 l de imprimación DMD exon 23 (Tabla 1).
  5. Utilice los siguientes parámetros para la reacción de PCR: 98 oC para 1 min, 35 ciclos de 98 oC para 10 s, 60 oC para 15 s, 72 oC para 30 s y una extensión final a 72 oC durante 1 min.
  6. Cargue la reacción de PCR en un gel de agarosa del 2%. Ejecuta el gel a 100 x 150 V durante 30 min.
  7. Inspeccione el gel bajo luz UV (la eficiencia de eliminación es 3/94).

13. Uso del sistema de activación MyoD Tet-on para diferenciar directamente iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC)

  1. Empaquete el ratón LV-TRE-VP64 MyoD-T2A-dsRedExpress2 y el ratón LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un regalo de Charles Gersbach)(Tabla de Materiales)como se describió anteriormente para los vectores lenti-CRISPRv2-blast y lenti-gRNA-iRFP670 en secciones 9 y 10.
  2. Infectar el ratón iPSC con lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 o lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 como se describió anteriormente para los vectores lenti-CRISPRv2-blast y lenti-gRNA-iRFP670 en los pasos 11.1-11.3.
  3. Seleccione las células con 1 g/ml de puromicina después de tres días de infección para obtener una población celular transducida pura.
  4. Añadir 3 g/ml de doxiciclina en los medios de cultivo (10% FBS DMEM) a la diferenciación MPC. Reemplace el medio fresco complementado con doxiciclina cada dos días.

14. PCR de transcripción inversa cuantitativa para evaluar la diferenciación muscular dinámica y la expresión DMD exon 22-24

  1. Extraer el ARN celular después de 0, 3, 6 y 10 días después del tratamiento con doxiciclina utilizando el reactivo de aislamiento de ARN, transcribir el ARN en el ADNc de primera hebra utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra(Tabla de materiales).
  2. Para el sistema de reacción qPCR de 20 l, añadir 1 l de ADNc, 10 l de tampón de reacción de PCR (Tabla de materiales), 8 ml de ADN H2O, y 1 l de mezcla de imprimaciones delanteras y inversas (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa [GAPDH], músculo esquelético [ACTA1], OCT4 y DMD exon22, DMD exon23 y DMD exon24, ver Tabla 1).
  3. Utilice los siguientes parámetros para la reacción de PCR: 50 oC durante 2 min, 95 oC para 2 min, 40 ciclos de 95 oC para 15 s, 60 oC durante 1 min, curva de fusión de 65,0 oC a 95,0 oC, incremento de 0,5 oC.

15. Manchado de inmunofluorescencia de la cadena pesada de miosina 2 (MYH2) y la expresión de proteína distrofina

  1. Placa de la placa inducida por doxiciclina, lenti-TRE-MyoD células modificadas desde el paso 13.4 sobre diapositivas de cultivo de 8 pocillos.
  2. Fijar las células en 4% formaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego lavar las diapositivas dos veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
  3. Bloquear las células con un diluyente de proteína sérica de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
  4. Añadir el anticuerpo conejo-anti-distrofina (1:300) y el anticuerpo ratón-anti-MYH2 (1:100) a los portaobjetos, incubar a 4oC durante la noche en una cámara humidificada.
  5. Deseche la solución primaria de anticuerpos, lave las células 3x (5 min/lavado) en PBS, agregue 1:400 anticuerpos conjugados Alexa488 conjugados y anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados Alexa555 a diapositivas, e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  6. Lave los portaobjetos 3x (5 min/lavado) en PBS, y monte las secciones con medio de montaje que contenga DAPI.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Establecimiento de fibroblastos cutáneos Dmdmdx derivados de iPSC. Demostramos la eficiencia de generar iPSCs de ratón a partir de ratones Dmdmdx derivados de fibroblastos cutáneo utilizando los vectores de reprogramación sin integración. La Figura 1A demostró que la aparición de colonias similares a células madre embrionarias (ESC) a las tres semanas después de la infección. Evaluamos la eficiencia de la inducción de iPSC por mancha de fosfat...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad hereditaria destructiva y, en última instancia, mortal caracterizada por la falta de distrofina, lo que conduce a la atrofia muscular progresiva1,2. Nuestros resultados demuestran la expresión del gen de la distrofina restaurada en las células progenitoras miogénicas derivadas de Dmdmdx iPSC mediante el enfoque de la eliminación del exón23 mediado por CRISPR/Cas9. Este enfoque tiene tres ventaja...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Tang y Weintraub fueron parcialmente compatibles con NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumentos
aguja de calibre 31Varios 
Incisión afiladavarios 
Bisturíes estérilesvarios 
PinzasVarios 
Medio fibroblasto (para 100 mL de medio completo)Número decatálogola empresaVolumen
2-Mercaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230,1 mL
Antibiótico Antimicótico Escoria 100xCORNINGMT30004CI1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - glucosa altaSIGMAD642987 mL
Fetal Suero Bovino CaracterizadoHyCloneSH30396.0310 mL
L-Glutamina soluciónSIGMAG75131 mL
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x) Gibco111400761 mL
Solución TVP (para 500 mL de solución completa)EmpresaNúmero de catálogoVolumen
Suero de polloGibco16110-0825 mL
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
Solucióna 500 mL
Tripsina (2,5%)Thermo150900465 mL
mES medio de crecimiento (para 500 mL de solución completa)Número de catálogo dela empresaVolumen
2-Mercaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230,5 mL
Antibiótico Antimicótico Escoria 100xMT30004CI5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medio - glucosa altaSIGMAD6429408.5 mL
Suero fetal bovino CaracterizadoHyCloneSH30396.0375 mL
L-Glutamina soluciónSIGMAG75135 mL
Factor inhibidor de leucemia (LIF) recombinante de ratón, 0.5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 μ L
Suplemento Inhibidor de MEK/GS3 EMDMillipore CorpCS210510-500UL500 μ L
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x) Gibco111400765 mL
Los medios de células madre embrionarias no deben almacenarse durante más de 4 semanas y con inhibidores no más de 2 semanas.
mES medio congelado (para 50 mL de solución completa)>Empresa>Número de catálogoVolumen
Dimetilsulfóxido (DMSO)SIGMAD26505 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - alta glucosaSIGMAD642924.9 mL
Suero Fetal Bovino CaracterizadoHyCloneSH30396.0325 mL
Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) recombinante de ratón, 0.5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 μ L
Nombre del material/equipo Número de catálogo dela empresaRRID
0,05% Tripsina/0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4% ParaformaldehídoThermo scientificJ19943-k2
Solución de accutasaSIGMAA6964Solución de desprendimiento de células
AgeI-HFNEBR3552L
Anticuerpo anti-ratón conjugado con Alexa488InvitrogenA32723AB_2633275
anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa488InvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-anticuerpo conjugado contra el conejoInvitrogenA32732AB_2633281
anti-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
anti-α-Smooth Actina muscular (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
anti-DistrofinaThermoPA5-32388
AB_2549858 anti-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641SAB_10997528
anti-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anti-Nanog-XPCST8822S
AB_11217637 anti-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anti-Sox2abcamab97959AB_2341193
anti-SSEA1 (MC480) CST4744sAB_1264258
anti-TH (H-196)SANTA CRUZ sc-14007AB_671397
Fosfatasa alcalina Tinción viva (500x)ThermoA14353
Blasticidina SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
CarbenicillinaMillipore205805-250MG
Colagenasa IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
Células CompetentesTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramaciónThermoA16517
DirectPCR Reactivo de lisis (celda)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispasa (1 U/mL)STEMCELL Technologies7923
Clorhidrato de doxiciclinaBioreactivos Fisher BP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
Fibronectina plasma bovinoSIGMAF1141
 
Kit de extracción de gel QIAEX II (500)		QIAGEN20051
Gelatina de piel porcina, tipo ASIGMAG1890
HardSet Medio de montaje antidecoloración con DAPIVectorH-1500
Higromicina B (50 mg/mL)Invitrogen10687010
Ketamina Inyección de HCLSCHEIN ANIMAL HEALTH45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfection KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene60625
LV-TRE-VP16 ratón MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
ratón sobre ratón (M.O.M.) Kit BásicoVector BMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Medios de sueroreducidos ThermoFisher31985070
Polietilenglicol 4.000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  BioCoat Poly-D-Lisina/Laminina Portaobjetosde cultivo CORNINGCB354688
PowerUp SYBR Mezcla maestra verdeThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremezclaTakaRaR045
Proteinasa KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Dihidrocloruro de puromicinaMP BiomedicalsICN19453980
lentivirus qPCR Kit de valoraciónabmLV900
Kit de ligadura rápidaNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
RevertAid RT Kit de transcripción inversaThermo scientificK1691
RNAzol RTCentro de Investigación Molecular, INCRN 190
T4 T4 Tampón de reacción de ADN ligasaNEBB0202S
T4 Polinucleótido quinasaNEBM0201S
Excelente caldo modificadoFisher BioReactivosBP9729-600
Reactivo ViralBoost (500x)ALSTEMVB100
quirúrgicos de salina tamponada con fosfato CORNING HENRY

Referencias

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Edici n g nica CRISPR Cas9restauraci n de la expresi n de la distrofinadistrofia muscular de Duchenneuni n de extremos no hom logosdeleci n del ex n 23diferenciaci n inducida por MyoDreprogramaci n mediante vector Sendaivalidaci n por PCRelectroforesis en gel de agarosa

Artículos relacionados