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Artículo de método

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

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DOI:

10.3791/59437

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21 de mayo de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

En este artículo

Resumen

Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.

Resumen

Las plantas han desarrollado un sistema inmunitario robusto para percibir patógenos y protegerse contra las enfermedades. Este artículo describe dos ensayos que se pueden utilizar para medir la fuerza de la activación inmune en Arabidopsis thaliana después del tratamiento con moléculas de eliitor. Presentado primero es un método para capturar la ráfaga oxidativa dinámica y inducida rápidamente, que se puede monitorear usando un ensayo a base de luminol. El segundo presentado es un método que describe cómo medir la inhibición inducida por el inmune del crecimiento de las plántulas. Estos protocolos son rápidos y confiables, no requieren capacitación especializada o equipo, y se utilizan ampliamente para entender la base genética de la inmunidad de las plantas.

Introducción

Para percibir y defenderse de patógenos, las plantas han evolucionado receptores de reconocimiento de patrones ligados a la membrana (PRR) que detectan moléculas microbianas conservadas fuera de la célula conocida como patrones moleculares asociados a microbios (MMP)1. La unión de los MAPP a sus PRR cognados inicia la señalización inmunemediada por proteínas quinasa, lo que da como resultado una resistencia a las enfermedades de amplio espectro 2. Una de las primeras respuestas después de la activación de PRR es la fosforilación y activación de proteínas de membrana plasmática integral RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalizan la producción de especies de oxígeno reactivo extracelular (ROS)3 , 4. ROS desempeña un papel importante en el establecimiento de la resistencia a la enfermedad, actuando tanto como mensajeros secundarios para propagar la señalización inmune como agentes antimicrobianos directos5. La primera observación de una ráfaga oxidativa inmune provocada se describió utilizando tubérculos de patata de cv. Rishiri después de la inoculación de Phytophthora infestans 6. La producción de ROS se ha evaluadoen varias especies vegetales utilizando discos de hojas 7, cultivos de suspensión celular8y protoplastias6. Aquí se describe un método simple para la determinación de la producción de ROS activada por patrones en discos de hojas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como respuesta a la percepción de MAMP, las proteínas RBOH activadas catalizan la producción de radicales de superóxido (O2-), radicales hidroxilo (•OH) y oxígeno singlete (1O2) que se convierten en peróxido de hidrógeno (H2O 2) en el espacio extracelular9. H2O2 se puede cuantificar mediante quimioluminiscencia a base de luminol en presencia del agente oxidante de peroxidasa de rábano picante (HRP)10. HRP oxida H2O2 generando un ion hidróxido (OH)y gas oxígeno (O2) que reaccionan con luminol para producir un intermedio inestable que libera un fotón de luz10. La emisión de fotones se puede cuantificar como unidades de luz relativa (RPU) utilizando un lector de microplacas o un imager capaz de detectar luminiscencia, que se han convertido en piezas estándar de equipos en la mayoría de los laboratorios moleculares. Mediante la medición de la luz producida en un intervalo de 40-60 minutos, se puede detectar una ráfaga oxidativa transitoria tan pronto como 2-5 minutos después del tratamiento del elicitor, alcanzando un máximo de 10-20 minutos y volviendo a los niveles basales después de 60 minutos11. La luz acumulativa producida a lo largo de este tiempo puede utilizarse como medida de la fuerza inmune correspondiente a la activación de las proteínas RBOH12. Convenientemente, este ensayo no requiere equipo especializado o preparación de muestras engorrosa.

Alcanzando el pico poco después de la detección de MAMP, la ráfaga oxidativa se considera una respuesta inmune temprana, junto con la activación mapK y la producción de etileno5. Las respuestas inmunitarias posteriores incluyen la reprogramación transcripcional, el cierre estomatal y la deposición de callosa2,5. La exposición prolongada a los MamPS activa continuamente la señalización inmune energéticamente costosa que resulta en la inhibición del crecimiento de las plantas, indicando un equilibrio entre el desarrollo y la inmunidad13. La inhibición del crecimiento de las plántulas activada por patrones (SGI) se utiliza ampliamente para evaluar la producción inmunitaria en Arabidopsis y ha sido parte integral de la identificación de varios componentes clave de la señalización inmune, incluidos los PRR14,15 ,16. Por lo tanto, este artículo presenta además un ensayo para SGI activado por patrón en Arabidopsis,por el cual las plántulas se cultivan en placas multipocillos que contienen medios estándar o medios complementados con un elicitor inmune durante 8-12 días y luego se pesan utilizando una escala analítica.

Para demostrar cómo se pueden utilizar los ensayos ROS y SGI para monitorear la señalización mediada por PRR, se eligieron tres genotipos que representan diferentes salidas inmunitarias: (1) el tipo salvaje Arabidopsis adhesión Columbia (Col-0), (2) el bak1-5 dominante-negativo mutante en el que el coreceptor multifuncional PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) no es funcional en la señalización inmune17,18,y (3) el mutante recesivo cpk28-1, que carece de la proteína reguladora CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) y muestra respuestas inmunitarias activadas19,20. Los ensayos ROS y SGI se presentan en respuesta a un epítopo de péptido elf18 producido sintéticamente de Factor de elongación bacteriano Tu (EF-Tu), reconocido en Arabidopsis por el PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Estos protocolos se pueden utilizar con otros eliitores inmunes como la proteína de motilidad bacteriana flagelina14 o las proteínas endógenas del elicitor vegetal (AtPeps)16, sin embargo, debe tenerse en cuenta que la capacidad de respuesta de la planta difiere dependiendo de la elicitor21. Juntos, los ensayos ROS y SGI se pueden utilizar para la evaluación rápida y cuantitativa de las respuestas mediadas por PRR tempranas y tardías.

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Protocolo

1. Detección de ráfaga de ROS en los discos de la hoja de Arabidopsis después de la elicitation inmune

  1. Crecimiento y mantenimiento de la planta.
    1. Para sincronizar la germinación, estratificar las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 ml de agar estéril 0.1% [w/v] y almacenar a 4oC (sin luz) durante 3-4 días.
      NOTA: Estratifica ralentí un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunes altas y bajas (por ejemplo, cpk28-1 y bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
    2. Sembrar semillas en el suelo y germinar en condiciones estándar de día corto (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m 2/s de intensidad lumínica y 65-70% de humedad relativa).
    3. Después de aproximadamente 7 días, utilice fórceps para trasplantar plántulas individuales a nuevas macetas, separadas por al menos 4 cm para permitir el desarrollo completo de rosetas. Trasplante 6-12 plántulas por genotipo y volver a condiciones estándar de días cortos. Agua y fertilizar regularmente las plantas (1 g/L de fertilizante 20-20-20 cada 2 semanas).
  2. Recoger discos de hoja en placas de 96 pocillos para la recuperación durante la noche.
    1. A las 4-5 semanas después de la germinación (Figura1A),utilice un punzón de biopsia agudo de 4 mm para extraer un disco de hoja por planta, evitando la vena media y teniendo cuidado de limitar la herida (Figura1B). Coloque los discos de hoja en una placa luminómetro de 96 pocillos no utilizada que contenga 100 ml de ddH2O con el lado adaxial hacia arriba para evitar la desecación22 (Figura1C). Si evalúa varios eliitores, retire 1 disco de hoja de la misma hoja para cada tratamiento de elicitor.
      NOTA: Hojas de muestra que están completamente expandidas, del tercer al quinto lugar desde la parte superior de la roseta, y aproximadamente del mismo tamaño y edad para limitar la variabilidad. Si es posible, corte los discos de hoja por la mitad utilizando una cuchilla de afeitar antes de la recuperación durante la noche, ya que esto aumenta la superficie expuesta a la solución de elicitor23.
    2. Recuperar durante la noche a temperatura ambiente para evitar la interferencia de ROS producida por la herida durante la recolección del disco de la hoja. Cubra las placas con una tapa para evitar la evaporación.
  3. Realice el tratamiento del elicitor y mida la producción de ROS.
    1. Programe el lector de placas antes de agregar la solución de reacción, ya que esto reducirá el tiempo entre el inicio de la ráfaga ROS y las primeras mediciones registradas. Utilice un software comercial que sea apropiado para el lector de placas. En nuestro caso (consulte Tabla de contenido), haga clic en Configuracióny seleccione el cartucho LUM96 y el Tipo de lectura cinética. Haga clic en la categoría Leer área y arrástrela para seleccionar un subconjunto de pozos o toda la placa que se va a leer. En la pestaña PMT y óptica, establezca el tiempo de integración en 1.000 ms. En la pestaña Tiempo de temporización, establezca el Tiempo total de ejecución en 40-60 min y el Intervalo en 2 min.
    2. Retire el agua de cada pocal con una pipeta multicanal.
      NOTA: No perfore los discos de las hojas, ya que esto puede causar tensión en las heridas y dar lugar a salidas ROS más variables.
    3. Preparar una solución de reacción que contenga 100 m de luminol, 10 g/ml de HRP y la concentración deseada de elicitor (por ejemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) en ddH2O estéril utilizando 10 ml de solución para una placa de 96 pocillos.
      NOTA: Disolver los péptidos liofilizados en H2O estériles en tubos de unión baja para hacer un material de 10 mM, congelar el flash en líquido N2y almacenar a -80 oC. Cuando esté listo para usar, diluir las existencias en H2O estéril para generar un stock de trabajo de 100 M y almacenar a -20 oC.
    4. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 100 ml de la mezcla de reacción a cada pocal, añadiendo la solución a todos los discos de hoja del mismo tratamiento al mismo tiempo22. Incluir una reacción de control (sin electique) para cada genotipo para evaluar los niveles basales de ROS en ausencia de elicitation. Mida inmediatamente la emisión de luz para todas las longitudes de onda del espectro visible utilizando un lector de microplacas.
      NOTA: Prepare y aplique la solución de reacción con poca luz, ya que luminol y HRP son reactivos sensibles a la luz. Mantenga los reactivos en hielo o a -20 oC a menos que estén en uso.
    5. Mida la emisión de luz con un tiempo de integración de 1.000 ms en intervalos de 2 minutos durante un período de 40-60 min en un lector de microplacas para capturar la ráfaga oxidativa dinámica (Figura1D).
      NOTA: Utilice un tiempo de integración más largo para mejorar la sensibilidad del ensayo11,a la vez que asegúrese de que todas las muestras de una placa de 96 pocillos se puedan medir en un intervalo.
  4. Interpretación de datos.
    1. Para cada genotipo, utilice una aplicación de hoja de cálculo para calcular el recuento medio de fotones y el error estándar en cada punto de tiempo, y muestre la producción de ROS en función del tiempo mediante una gráfica de dispersión.
      figure-protocol-1
      Donde t á cada punto de tiempo
    2. Alternativamente, sume los recuentos de fotones para cada disco hoja y presente el promedio de estos valores para cada genotipo utilizando un gráfico de barras con barras de error estándar o una gráfica de caja y bigote.
      figure-protocol-2

2. Ensayo de inhibición del crecimiento de la plántula

  1. Esterilice las semillas y siembre en las placas Murashige y Skoog (MS).
    1. Preparar medio grado estéril (0,5x) medio DeM (2,16 g/L) que contenga 0,8% de agar [p/v]. Vierta el medio en placas (90 x 15 mm) en una campana de flujo laminar.
    2. Esterilice aproximadamente 100 semillas en un tubo de microcentrífuga lavando con 1 ml de etanol al 70% durante 2 min y retírelas por aspiración. Añadir 1 mL de 40% de lejía y rociar suavemente durante 17 minutos a temperatura ambiente. Retire la lejía por aspiración y lave tres veces en 1 ml de agua estéril durante 5 min. Resuspender en 1 ml de agar estéril 0,1%.
      NOTA: Alternativamente, utilice un protocolo de esterilización de semillas de gas de cloro24.
    3. Sembrar aproximadamente 100 semillas por genotipo en placas de agar MS usando una pipeta y sellar con cinta de microporo en una campana de flujo laminar.
      NOTA: Evite colocar las semillas cerca, ya que esto dificultará el trasplante de plántulas más adelante.
    4. Estratificar las semillas colocando las placas a 4oC (sin luz) durante 3-4 días para sincronizar la germinación (Figura2A).
  2. Trasplante de plántulas en placas de 48 pocillos que contienen péptidos elicitores inmunes.
    1. Después de la estratificación, mueva las placas a la luz en condiciones de día corto (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidad lumínica y 65-70% de humedad relativa) durante 3-4 días para permitir la germinación.
    2. En una campana de flujo laminar, prepare diluciones de péptido sicitor (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1,000 nM) en medios líquidos estériles 0,5x MS que contengan 1% de sacarosa [p/v], utilizando 25 ml de MS para cada placa de 48 pocillos. Preparar las placas pipeteando 500 ml de medio líquido de LA MS o medio de SM que contenga péptidos por poca. Si está disponible, utilice un pipeteador repetido para la preparación de placas para acelerar el proceso.
      NOTA: Para cada genotipo, cultivar plántulas en LA MS sin elicitor para explicar cualquier diferencia inherente en el crecimiento de las plántulas.
    3. Usando fórceps estériles cuidadosamente trasplantaunar una plántula a cada pozo del mismo tamaño y edad, asegurando que no haya daño a la plántula o rotura en la raíz y que la raíz esté sumergida en los medios. Para cada genotipo, trasplantar un mínimo de 6-8 plántulas en cada dilución de péptidos (Figura2B).
      NOTA: Las plántulas de trasplante a los 4 días después de la germinación, ya que las raíces cortas son más fáciles de manipular, y las plántulas más antiguas pueden producir resultados menos óptimos.
    4. Sellar las placas con cinta adhesiva de microporos y volver a la luz en condiciones estándar de días cortos (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidad de luz y 65-70% de humedad relativa). Permita que las plántulas crezcan durante 8-12 días.
  3. Determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento.
    1. Retire cuidadosamente las plántulas de los platos de 48 pocillos y séquelo con una toalla de papel. Pesar las plántulas en una escala analítica y registrar valores. Si está disponible, utilice una báscula analítica equipada con salida USB para registrar valores de peso fresco en una hoja de cálculo. Antes de pesar las plántulas, tome una foto para mostrar visualmente la inhibición del crecimiento (Figura 2C).
    2. Determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento de las plántulas tratadas con elicitor en comparación con las plántulas cultivadas solo en LA MS (Figura2D)de la siguiente manera:
      figure-protocol-3
    3. Trazar datos utilizando un gráfico de barras con barras de error estándar o utilizando un diagrama de caja y bigote para mostrar mejor la varianza interexperimental.

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Resultados

Mutantes cpk28-119,25 y bak1-517,se utilizaron18 plantas para demostrar los resultados esperados para los genotipos con respuestas inmunitarias altas y bajas, respectivamente, en ráfaga oxidativa y SGI ensayos relativos a un control de fondo de tipo salvaje (Col-0). Para evaluar los efectos dependientes de la dosis, se utilizó una serie de dilución de pép...

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Discusión

Este artículo describe dos métodos para evaluar las respuestas inmunitarias activadas por patrones en Arabidopsis,ofreciendo enfoques cuantitativos para evaluar la producción inmune sin el uso de equipos especializados. En combinación, ROS y SGI activados por patrones se pueden utilizar para evaluar las respuestas tempranas y tardías a la percepción de los microbios, respectivamente.

La principal limitación del ensayo de ráfaga oxidativa es la variabilidad. Por razones que no se entie...

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Agradecimientos

El trabajo en nuestro laboratorio se financia a través del Programa de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), el Fondo de Líderes John R. Evans de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Universidad de Queen. KS e IS cuentan con el apoyo de becas de posgrado en tándem Ontario y becas de posgrado NSERC Canadá para estudiantes de maestría (CGS-M).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20-20-20 FertilizantePlant Prod10529Mezclar 1g/L en agua y aplicar a las plantas cada 2 semanas para un crecimiento óptimo.
Punzón de biopsia de 4 mmMedical Mart232-33-34-PTambién se puede utilizar un juego de barrenadores de corcho con una superficie de 0,125 cm^2.
Placas estériles de 48 pocillos con tapaSigma-AldrichCLS3548
Báscula analítica con tiro SheidVWRVWR-225ACCualquier escala analítica estándar se puede utilizar para ensayos de incidencia de crecimiento, sin embargo, una salida directa por computadora es óptima.
BioHit mLine Mechanical 12 Pipeta Multicanal (30-300 uL)Sartorius725240Se puede utilizar cualquier pipeta multicanal, al igual que una sola pipeta si es necesario.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Almacene 10 mM de péptido caldo a -80C en tubos de unión a proteínas bajas. Cuando se descongele, almacene 100 uM de material de trabajo a -20 °C.
PinzasFisher Scientific22-327379
Rábano picante PeroxidasaSigma-AldrichP6782Disolver en agua pura. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
LuminolSigma-AldrichA8511se disuelve en DMSO. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
Sales basales de Murisage y SkoogCedarlane LabsMSP09-100LTTienda en 4C.
SoilSunGrow HorticultureSunshine Mix #1Otros tipos de suelo también se pueden utilizar para cultivar Arabidopsis. Mezclar con agua al llenar las ollas.
SpectraMax Paradigm Lector de microplacas multimodo con módulo LUMDispositivos molecularesDebe solicitar un presupuestoCualquier lector de placas capaz de detectar luminiscencia puede utilizarse para estos ensayos.
SacarosaSigma-AldrichS0389-1KGConservar a temperatura ambiente.
Placas de poliestireno blanco de 96 pocillosFisher Scientific07-200-589

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