Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Resumen

Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.

Resumen

Las plantas han desarrollado un sistema inmunitario robusto para percibir patógenos y protegerse contra las enfermedades. Este artículo describe dos ensayos que se pueden utilizar para medir la fuerza de la activación inmune en Arabidopsis thaliana después del tratamiento con moléculas de eliitor. Presentado primero es un método para capturar la ráfaga oxidativa dinámica y inducida rápidamente, que se puede monitorear usando un ensayo a base de luminol. El segundo presentado es un método que describe cómo medir la inhibición inducida por el inmune del crecimiento de las plántulas. Estos protocolos son rápidos y confiables, no requieren capacitación especializada o equipo, y se utilizan ampliamente para entender la base genética de la inmunidad de las plantas.

Introducción

Para percibir y defenderse de patógenos, las plantas han evolucionado receptores de reconocimiento de patrones ligados a la membrana (PRR) que detectan moléculas microbianas conservadas fuera de la célula conocida como patrones moleculares asociados a microbios (MMP)¹. La unión de los MAPP a sus PRR cognados inicia la señalización inmunemediada por proteínas quinasa, lo que da como resultado una resistencia a las enfermedades de amplio espectro 2. Una de las primeras respuestas después de la activación de PRR es la fosforilación y activación de proteínas de membrana plasmática integral RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (....

Protocolo

1. Detección de ráfaga de ROS en los discos de la hoja de Arabidopsis después de la elicitation inmune

1. Crecimiento y mantenimiento de la planta.
   1. Para sincronizar la germinación, estratificar las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 ml de agar estéril 0.1% [w/v] y almacenar a 4oC (sin luz) durante 3-4 días.
      NOTA: Estratifica ralentí un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunes altas y bajas (por ejemplo, cpk28-1 y bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
   2. Sembrar semillas en el suelo y germinar en condicion....

Resultados

Mutantes cpk28-1^19,25 y bak1-5^17,se utilizaron¹⁸ plantas para demostrar los resultados esperados para los genotipos con respuestas inmunitarias altas y bajas, respectivamente, en ráfaga oxidativa y SGI ensayos relativos a un control de fondo de tipo salvaje (Col-0). Para evaluar los efectos dependientes de la dosis, se utilizó una serie de dilución de pép.......

Discusión

Este artículo describe dos métodos para evaluar las respuestas inmunitarias activadas por patrones en Arabidopsis,ofreciendo enfoques cuantitativos para evaluar la producción inmune sin el uso de equipos especializados. En combinación, ROS y SGI activados por patrones se pueden utilizar para evaluar las respuestas tempranas y tardías a la percepción de los microbios, respectivamente.

La principal limitación del ensayo de ráfaga oxidativa es la variabilidad. Por razones que no se entie.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
20-20-20 Fertilizante	Plant Prod	10529	Mezclar 1g/L en agua y aplicar a las plantas cada 2 semanas para un crecimiento óptimo.
Punzón de biopsia de 4 mm	Medical Mart	232-33-34-P	También se puede utilizar un juego de barrenadores de corcho con una superficie de 0,125 cm^2.
Placas estériles de 48 pocillos con tapa	Sigma-Aldrich	CLS3548
Báscula analítica con tiro Sheid	VWR	VWR-225AC	Cualquier escala analítica estándar se puede utilizar para ensayos de incidencia de crecimiento, sin embargo, una salida directa por computadora es óptima.
BioHit mLine Mechanical 12 Pipeta Multicanal (30-300 uL)	Sartorius	725240	Se puede utilizar cualquier pipeta multicanal, al igual que una sola pipeta si es necesario.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	cp7211	Almacene 10 mM de péptido caldo a -80C en tubos de unión a proteínas bajas. Cuando se descongele, almacene 100 uM de material de trabajo a -20 °C.
Pinzas	Fisher Scientific	22-327379
Rábano picante Peroxidasa	Sigma-Aldrich	P6782	Disolver en agua pura. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
Luminol	Sigma-Aldrich	A8511	se disuelve en DMSO. Almacene a -20 ° C y lejos de la luz.
Sales basales de Murisage y Skoog	Cedarlane Labs	MSP09-100LT	Tienda en 4C.
Soil	SunGrow Horticulture	Sunshine Mix #1	Otros tipos de suelo también se pueden utilizar para cultivar Arabidopsis. Mezclar con agua al llenar las ollas.
SpectraMax Paradigm Lector de microplacas multimodo con módulo LUM	Dispositivos moleculares	Debe solicitar un presupuesto	Cualquier lector de placas capaz de detectar luminiscencia puede utilizarse para estos ensayos.
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389-1KG	Conservar a temperatura ambiente.
Placas de poliestireno blanco de 96 pocillos	Fisher Scientific	07-200-589