Demostramos la síntesis de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para la entrega eficaz de oligonucleótidos in vitro e in vivo. Nanopartículas de silicio poroso están cargadas de siRNA para formar el núcleo, que es cubierto por fusogénicas lípidos a través de la protuberancia para formar la cáscara. Funcionalización de parte de la segmentación y caracterización de partículas están incluidos.
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Artículo de método
Síntesis, funcionalización y caracterización de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para entrega de oligonucleótidos
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el advenimiento de la terapia génica, ha sido el desarrollo de un sistema de entrega de efectivo en vivo nucleótido-carga de importación paralela. Nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) recientemente han demostrado alta eficacia debido a su alta capacidad de cargamento y vía única absorción celular que evita la endocitosis de oligonucleótidos de silenciamiento del gen en vivo. La síntesis de F-pSiNPs es un proceso de múltiples paso que incluye: (1) de carga y sellado de cargas útiles de los oligonucleótidos en los poros de silicio; (2) simultánea capa y apresto de lípidos fusogénicas alrededor de los núcleos de silicio poroso; y (3) Conjugación de dirigidos a péptidos y lavado para eliminar exceso de oligonucleótidos, restos de silicio y péptidos. Uniformidad de tamaño de partícula se caracteriza por la dispersión ligera dinámica y su estructura de core-shell puede ser verificada por microscopía electrónica de transmisión. La absorción fusogénicas es validada por cargar un lipofílico del tinte, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), en el bilayer del lípido fusogénicas y tratar a las células in vitro para observar membrana de plasma versus la coloración endocíticas localizaciones. Previamente se cuantificaron los efficacies gene silenciamiento de segmentación e in vivo en un modelo murino de neumonía por Staphylococcus aureus en el targeting peptide se espera que a la F-pSiNPs a casa en el sitio de la infección. Más allá de su aplicación en S. aureus la infección, el sistema de F-pSiNP puede utilizarse para entregar cualquier oligonucleótidos para terapia del gene de una amplia gama de enfermedades, incluyendo infecciones virales, cáncer y enfermedades autoinmunes.
Introducción
Terapia génica modula la expresión del gen específico para obtener un resultado terapéutico. Numerosas herramientas para modulación de genes han sido descubiertos y estudiados, incluyendo el ácido ribonucleico de interferencia (ARNi) usando oligonucleótidos (por ejemplo, corta interferencia RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ADN plásmidos5,6, nucleasas (p. ej., dedo de zinc, TALENS)7,8y CRISPR/Cas9 sistemas9<....
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Protocolo
1. síntesis de nanopartículas de silicio poroso (pSINPs)
PRECAUCIÓN: Siempre tenga cuidado al trabajar con ácido fluorhídrico (HF). Siga a todas las guías de seguridad según su hoja de datos de seguridad (SDS), manejar productos químicos que contiene HF en una campana de humos y usar equipo de protección personal (PPE, guantes doble con guantes de butilo en el exterior, delantal de butilo con bata de laboratorio por debajo, cara proteger con gafas de seguridad debajo). Todas las universidades y laboratorios de investigación y desarrollo requieren una formación específica en seguridad de HF antes de uso. No intente trabajar con HF sin aprobaci....
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Resultados
Una síntesis exitosa de fusogénicas pSiNPs debe producir una solución homogénea, ligeramente opaca (figura 3a). Fracaso para optimizar la relación y la concentración de pSiNPs: siRNA: CaCl2 puede conducir a la agregación a la carga (figura 3b). Como se sacan las partículas a través de 200 membranas nm, el diámetro medio de la hidrodinámico de la pSiNPs fusogénicas medido por DLS debe ser aproximadamente 200 nm y el mV .......
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Discusión
Síntesis de nanopartículas de silicio poroso se muestran en la figura 5. El paso crítico en la síntesis de pSiNPs fusogénicas es en el paso de carga (paso 3). Si las nanopartículas fusogénicas están agregando la síntesis (figura 3), la razón puede deberse a lo siguiente: (1) stock de cloruro de calcio forma homogénea no estaba preparada, así paso 3.1.2 debe ser cuidadosamente seguido o refinado; o (2) la relación de pSiNP: siRNA: CaCl2 o la concentrac.......
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Divulgaciones
MJS es un científico fundador de Spinnaker Biosciences, Inc. y tiene una participación en la empresa. Aunque esta subvención ha sido identificada para la gestión de conflictos de interés basado en el alcance general del proyecto y su potencial beneficio a Spinnaker Biosciences, Inc., los resultados de las investigaciones incluidos en esta publicación particular pueden no necesariamente se relacionan con los intereses de Spinnaker Biosciences, Inc. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobados por la Universidad de California, San Diego según sus políticas de conflicto de intereses. Otros autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por los institutos nacionales de salud a través de contrato # R01 AI132413-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) | Avanti Lípidos Polares | 850345P | Polvo |
| 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (sal de cloruro) (DOTAP) | Avanti Lípidos Polares | 890890P | Polvo |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[maleimida (polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (DSPE-PEG(2000) Maleimida) | Avanti Lípidos Polares | 880126P | Polvo |
| Papel de aluminio | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhidro, |
| Pellets Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computadora | Dell | Dimension 9200 | Cualquier computadora con ranura para tarjeta PCI es aceptable |
| Tinción de Dil (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato ('DiI'; DiIC18(3)))Life | Technologies | D3911 | |
| Etanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 |
| Proof Ácido hidroflurico (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Pureza: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Programa de muestra disponible en: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Juego de extrusión de liposomas con bloque calefactor | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrífuga Unidad de filtrado | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| junta tórica | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Bobina de platino | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Oblea | ||
| Siltronix | Pedido | ||
| siRNA | Dharmacon | Pedido personalizado | IRF5, sense 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' y antisense 5'-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3' |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Péptido objetivo (CRV) | CPC Scientific | Secuencia de pedidos personalizada | CRVLRSGSC; hecho cíclico por un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de los dos residuos de cisteína |
| Célula de grabado de teflón | Interface Performance Materials, Inc. | Pedido | |
| Agua destilada ultrapura de DNasa / RNasa sin resina; | Thermo Fisher Scientific 10977015 |
Referencias
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. ....
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Reimpresiones y permisos
