Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.
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Artículo de método
Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares
En este artículo
Resumen
Resumen
En el sistema nervioso central, un par de neuronas forman a menudo múltiples contactos sinápticos o sitios de liberación de neurotransmisor funcional (multiplicidad sináptica). Multiplicidad sináptica es de plástico y cambios a lo largo de desarrollo y en diferentes condiciones fisiológicas, siendo un factor determinante para la eficacia de la transmisión sináptica. Aquí, describimos experimentos para estimar el grado de multiplicidad de sinapsis que termina en una neurona postsináptica dada utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo. Concretamente, grabación de pinza de voltaje se utiliza para comparar la diferencia entre la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs) y miniatura corrientes postsinápticas excitatorias (mEPSCs). La teoría detrás de este método es que las entradas aferentes que exhiben multiplicidad mostrará sEPSCs grande, dependiente del potencial de acción debido a la liberación sincrónica que se produce en cada contacto sináptico. Por el contrario, lanzamiento independiente del potencial de acción (que es asincrónico) generará más pequeño amplitud mEPSCs. Este artículo describe un conjunto de experimentos y análisis para caracterizar la existencia de multiplicidad de synaptic y discute los requisitos y limitaciones de la técnica. Esta técnica puede aplicarse para investigar cómo las diferentes intervenciones conductuales, farmacológicas o ambientales en vivo afectan la organización de contactos sinápticos en diversas áreas del cerebro.
Introducción
Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales1. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnme....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de Ontario Occidental según el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal (AUP #2014-031).
1. las soluciones
-
Solución de corte
- Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de corte.
- Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
- 1 x solución corte, disolver NaHCO3, glucosa y sacarosa en ddH2O y añadir el caldo de 20 x. Garantizar la osmolaridad entre los 315-320 mOsm y almacenar la solu....
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Resultados
El anterior protocolo describe un método para el uso de electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera para examinar el grado de multiplicidad sináptica, mediante neuronas hipotalámicas de ratón como un ejemplo. Esta técnica de preparación de rebanada debe generar células viables sanas que no tienen una membrana hinchada o núcleo (figura 1). Cada paso en el protocolo es importante para la salud del tejido y la calidad de las grabaciones.
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Discusión
Un requisito importante para un éxito parche abrazadera electrofisiológico experimento es la obtención de rodajas/las células sanas. Nuestro protocolo descrito está optimizado para rebanadas hipotalámicas que contienen neuronas PVN. Otro cerebro áreas pueden requerir modifica soluciones y corte métodos21,22,23,24. Para la grabación, es crítica para aceptar sólo grabaciones estables controlando .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
J.S. Beca Ontario Graduate. Panamá recibió una nueva beca de investigador de investigación de Salud Mental de Canadá. Este trabajo es apoyado por subvenciones de funcionamiento para W.I de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (06106-2015 RGPIN) y el Instituto canadiense de investigación en salud (PJT 148707).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 1 ml | BD | 309659 | |
| 10 hojas | Fisher Scientific/otros | 35698 | |
| 22 hojas | VWR/otros | 21909-626 | |
| 22 μ Filtros de jeringa M | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Tijeras afiladas en ángulo | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Hoja de doble filo | VWR | 74-0002 | |
| Papel de filtro | Sigma/otros | 1001090 | |
| Pincel fino | Fisher/varios | 15-183-35/varios | |
| Tubo de dispersión de gas | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurano | Fresenius Kabi/otros | M60303 | |
| Pegamento Krazy | varios | varios Varios | |
| Mini análisis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Modelo 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pipeta Pasteur | VWR | 14672-200 | |
| ph metro | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Bombilla de goma | VWR | 82024-550 | |
| Mango de bisturí n.º 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Mango de bisturí n.º 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Cuchilla de un solo filo | VWR | 55411-050 | |
| Cortadora de vibratomo | Leica | VT1200S | |
| Millipore | Milli-Q Academic A10 | ||
| Tapa de placa | de pozo Fisher/varios | 07-201-590/varios | |
| químicos/reactivos | |||
| Sondas moleculares | 4-AP | ||
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucosa | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconato | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Grado de biología molecular agua | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconato | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxina | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sacarosa | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
Referencias
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
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Reimpresiones y permisos
