Method Article

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.

Abstract

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En el sistema nervioso central, un par de neuronas forman a menudo múltiples contactos sinápticos o sitios de liberación de neurotransmisor funcional (multiplicidad sináptica). Multiplicidad sináptica es de plástico y cambios a lo largo de desarrollo y en diferentes condiciones fisiológicas, siendo un factor determinante para la eficacia de la transmisión sináptica. Aquí, describimos experimentos para estimar el grado de multiplicidad de sinapsis que termina en una neurona postsináptica dada utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo. Concretamente, grabación de pinza de voltaje se utiliza para comparar la diferencia entre la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs) y miniatura corrientes postsinápticas excitatorias (mEPSCs). La teoría detrás de este método es que las entradas aferentes que exhiben multiplicidad mostrará sEPSCs grande, dependiente del potencial de acción debido a la liberación sincrónica que se produce en cada contacto sináptico. Por el contrario, lanzamiento independiente del potencial de acción (que es asincrónico) generará más pequeño amplitud mEPSCs. Este artículo describe un conjunto de experimentos y análisis para caracterizar la existencia de multiplicidad de synaptic y discute los requisitos y limitaciones de la técnica. Esta técnica puede aplicarse para investigar cómo las diferentes intervenciones conductuales, farmacológicas o ambientales en vivo afectan la organización de contactos sinápticos en diversas áreas del cerebro.

Introduction

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Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales1. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnme....

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Protocol

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Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de Ontario Occidental según el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal (AUP #2014-031).

1. las soluciones

  1. Solución de corte
    1. Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de corte.
    2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
    3. 1 x solución corte, disolver NaHCO3, glucosa y sacarosa en ddH2O y añadir el caldo de 20 x. Garantizar la osmolaridad entre los 315-320 mOsm y almacenar la solu....

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Results

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El anterior protocolo describe un método para el uso de electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera para examinar el grado de multiplicidad sináptica, mediante neuronas hipotalámicas de ratón como un ejemplo. Esta técnica de preparación de rebanada debe generar células viables sanas que no tienen una membrana hinchada o núcleo (figura 1). Cada paso en el protocolo es importante para la salud del tejido y la calidad de las grabaciones.

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Discussion

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Un requisito importante para un éxito parche abrazadera electrofisiológico experimento es la obtención de rodajas/las células sanas. Nuestro protocolo descrito está optimizado para rebanadas hipotalámicas que contienen neuronas PVN. Otro cerebro áreas pueden requerir modifica soluciones y corte métodos21,22,23,24. Para la grabación, es crítica para aceptar sólo grabaciones estables controlando .......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.S. Beca Ontario Graduate. Panamá recibió una nueva beca de investigador de investigación de Salud Mental de Canadá. Este trabajo es apoyado por subvenciones de funcionamiento para W.I de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (06106-2015 RGPIN) y el Instituto canadiense de investigación en salud (PJT 148707).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jeringa de 1 mlBD309659
10 hojasFisher Scientific/otros35698
22 hojasVWR/otros21909-626
22 μ Filtros de jeringa MMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Tijeras afiladas en ánguloHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Hoja de doble filoVWR74-0002
Papel de filtroSigma/otros1001090
Pincel finoFisher/varios15-183-35/varios
Tubo de dispersión de gasVWRLG-8680-120
IsofluranoFresenius Kabi/otrosM60303
Pegamento Krazyvariosvarios Varios
Mini análisisSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModelo 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pipeta PasteurVWR14672-200
ph metroMettler ToledoFE20-ATC
Bombilla de gomaVWR82024-550
Mango de bisturí n.º 3Harvard Instruments72-8350
Mango de bisturí n.º 4Harvard Instruments72-8356
Cuchilla de un solo filoVWR55411-050
Cortadora de vibratomoLeicaVT1200S
MilliporeMilli-Q Academic A10
Tapa de placade pozo Fisher/varios07-201-590/varios
químicos/reactivos
Sondas moleculares4-AP
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glucosaSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconatoSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Grado de biología molecular aguaSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconatoSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotoxinasigmaP1675
SrClSigma255521
sacarosaBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1
Sistema de purificación de agua Sigma 275875 BAPTA B1204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

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Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

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