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Artículo de método

VirWaTest, un método de punto de uso para la detección de virus en muestras de agua

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DOI:

10.3791/59463

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11 de mayo de 2019

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1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos VirWaTest, que es un método simple, asequible y portátil para la concentración y detección de virus de muestras de agua en el punto de uso.

Resumen

Los virus excretados por humanos y animales pueden contaminar las fuentes de agua y representar un riesgo para la salud humana cuando esta agua se utiliza para beber, irrigación de alimentos, lavado, etc. El indicador clásico de bacterias fecales no siempre comprueba la presencia de patógenos virales, por lo que la detección de patógenos vímicos e indicadores virales es relevante para adoptar medidas de mitigación del riesgo, especialmente en escenarios humanitarios y en zonas cuando los brotes virales transmitidos por el agua son frecuentes.

En la actualidad, varias pruebas comerciales que permiten la cuantificación de bacterias indicadoras fecales (FIB) están disponibles para su análisis en el punto de uso. Sin embargo, tales pruebas comerciales no están disponibles para la detección de virus. La detección de virus en muestras de agua ambiental requiere concentrar varios litros en volúmenes más pequeños. Además, una vez concentrado, la detección de virus se basa en métodos como la extracción de ácido nucleico y la detección molecular (por ejemplo, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) de los genomas virales.

El método descrito aquí permite la concentración de virus a partir de muestras de agua de 10 L, así como la extracción de ácidos nucleicos virales en el punto de uso, con equipos simples y portátiles. Esto permite la prueba de muestras de agua en el punto de uso de varios virus y es útil en escenarios humanitarios, así como en cualquier contexto donde no se dispone de un laboratorio equipado. Alternativamente, el método permite concentrar los virus presentes en las muestras de agua y el envío del concentrado a un laboratorio a temperatura ambiente para su posterior análisis.

Introducción

Durante las primeras fases de cualquier emergencia humanitaria, el acceso a suministros de agua potable, saneamiento e higiene es fundamental para la supervivencia de los afectados. Por lo tanto, el control de la calidad del agua es una prioridad para prevenir brotes transmitidos por el agua. Es bien sabido que el agua contaminada es con frecuencia el origen de las enfermedades, pero a menudo es difícil determinar las fuentes de brotes virales como el virus de la hepatitis E (HEV), incluso con la disponibilidad de métodos de laboratorio convencionales. El control de la calidad del agua se basa en la cuantificación de FIB1,2,3,4. Sin embargo, se ha documentado ampliamente que no existe correlación entre la ausencia de FIB y la presencia de patógenosvirales transmitidos por el agua como rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV 5,6. Por lo tanto, el uso de los criterios de calidad del agua basados en la FIB podría dar lugar a una subestimación de los riesgos asociados con la presencia de patógenos virales transmitidos por el agua. La vigilancia de los virus indicadores, como los adenovirus humanos (HAdV), o patógenos específicos sería útil para definir la exposición a patógenos víricas e identificar la fuente potencial de infección humana7,8, 9,10 y en la validación de la eficacia de las medidas de saneamiento11.

Hasta ahora, la detección de virus en estos escenarios dependía de personal cualificado y logística compleja. VirWaTest (virwatest.org) está dirigido al desarrollo de un método simple, asequible y portátil para la concentración y posterior detección de virus a partir de muestras de agua en el punto de uso.

La concentración del virus se basa en el principio de floculación orgánica de muestras de agua de 10 L, mediante la cual los virus se recuperan en volúmenes más pequeños12,13. Los flocs se recogen y se añaden a un tampón que lyses los virus y evita que los ácidos nucleicos de degradación cuando se almacenaron a temperatura ambiente durante no más de 2 semanas.

El método de extracción de ácido nucleico se basa en el uso de partículas magnéticas a las que los ácidos nucleicos se absorben. Se pueden transferir de un tampón de lavado a otro y finalmente al tampón de elución mediante el uso de una pipeta magnética a la que se adhieren las partículas. Las suspensiones de ácido nucleico viral obtenidas se pueden enviar a un laboratorio de referencia donde la detección se puede realizar utilizando métodos moleculares basados en PCR. Para cada extracción de ácido nucleico, se prueban dos cantidades diferentes para descartar la inhibición enzimática originada por la muestra. Alternativamente, con una disponibilidad mínima del equipo, las pruebas de PCR se pueden ejecutar en el punto de uso. Todo el proceso está diseñado para realizarse independientemente de una fuente de alimentación (Figura1).

Un ensayo cuantitativo de PCR para detectar el Vhv, excretado por los seres humanos y encontrado en muestras de aguas residuales en altas concentraciones, se ha adaptado para ser ejecutado en el punto de uso. HAdV se utilizan como indicadores virales fecales humanos. También se ha adaptado un PCR para la cuantificación del bacteriófago MS2 desde que MS2 se utiliza en VirWaTest como control de procesos. El método se puede personalizar para la detección de cualquier virus de interés.

Después del desarrollo, el método VirWaTest ha sido aplicado por los usuarios en dos configuraciones diferentes en la República de Frica Central (RCA) y Ecuador, proporcionando retroalimentación sobre la aplicación del protocolo en situaciones reales.

Hasta nuestro punto de conocimiento, este es el primer procedimiento que permite la concentración y detección de virus en el punto de uso, independientemente de cualquier fuente de alimentación, equipos de gran tamaño y condiciones de congelación/refrigeración. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua con el fin de obtener resultados robustos.

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Protocolo

1. Preparación y envasado

NOTA: Los materiales/equipos que se van a embalar se enumeran en la Tabla1. Utilice guantes para manipular los reactivos necesarios para el control del proceso, los reactivos de concentración, los reactivos de extracción de ácido nucleico y los reactivos de detección. Use gafas protectoras para manipular los reactivos necesarios para la extracción de ácido nucleico.

  1. Control de procesos
    1. Preparar el cultivo de poblaciones de bacteriófagos MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) que contiene 1 x 1010 PFU/mL en el laboratorio siguiendo el procedimiento ISO 10705-1:199514.
    2. A continuación, la alícuota de 10 ml de la suspensión por tubo que contiene 1 x 108 PFU en tubos de 10 ml y dejar que el agua se evapore a 37 oC. Utilice un tubo por muestra de agua.
    3. Además, prepare un tubo que contenga 10 ml de agua destilada estéril por muestra recogida.
  2. Reactivos de concentración
    1. Para la solución de leche desnatada prefloculada (PSM), utilice las siguientes cantidades para concentrar cinco muestras de agua de 10 L.
      1. Preparar un tubo de plástico que contenga 5 g de leche desnatada.
      2. Prepare una bolsa de plástico con cremallera que contenga 16,66 g de sales marinas.
      3. Preparar una botella de plástico que contenga 500 ml de agua destilada.
    2. Prepare los reactivos necesarios para el ajuste del pH. Utilice las siguientes cantidades para ajustar el pH del PSM y de cinco muestras de agua de 10 L.
      1. Añadir 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a un tubo de plástico de 10 ml.
        ADVERTENCIA: El ácido cítrico causa irritación grave cuando entra en contacto con los ojos. Si esto ocurre, enjuague el ojo con precaución durante varios minutos. Si la irritación persiste, consulte a un médico.
      2. Poner 2 g de hidróxido de sodio en un tubo de plástico de 10 ml.
        ADVERTENCIA: El hidróxido de sodio puede causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Si se ingiere, enjuague la boca. No induzca el vómito. Si entra en contacto con los ojos, enjuague con precaución con agua durante varios minutos. Luego, busque consejo médico.
      3. Poner 25 ml de agua destilada estéril en un recipiente de plástico.
      4. Poner 50 ml de agua destilada estéril en un recipiente de plástico.
    3. Preparar el sobre acondicionador de muestra utilizado para la floculación, la solución conservante utilizada para preservar los ácidos nucleicos, y el sobre neutralizante para neutralizar el agua y los materiales desechados. Utilice las siguientes cantidades para cada muestra de agua de 10 L que se va a probar.
      1. Poner 15 g de sales de mar y 8 g de ácido cítrico 1-hidrato en una bolsa de plástico con cremallera para el sobre acondicionador.
      2. Añadir 2 ml de tampón de lisis (Tablade materiales)y 0,3 ml de agente conservante de ácido nucleico (Tablade materiales)a un tubo de 5 ml.
        ADVERTENCIA: El tampón de lysis contiene tiocianato de guanidina y Triton X-100. El contacto con ácido libera gases tóxicos, y es dañino si se ingiere, inhala o entra en contacto con la piel. Si se ingiere, enjuague la boca. No induzca el vómito. Si entra en contacto con la piel, lave con abundante agua. Luego, busque consejo médico. El agente conservante del ácido nucleico causa irritación de la piel y los ojos y es dañino si se ingiere. Si entra en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua durante varios minutos. En cualquier caso, especialmente si se ingiere y se siente mal, busque consejo médico.
      3. Ponga 40 g de detergente en polvo en cuatro bolsas de plástico con cremallera.
        ADVERTENCIA: El detergente en polvo causa irritación ocular. Si entra en contacto con los ojos, enjuague con abundante agua durante varios minutos. Si la irritación persiste o si se ingiere, consulte a un médico.
  3. Reactivos de extracción de ácido nucleico
    1. Poner 50 l de partículas magnéticas (Tablade materiales)y 1 ml de etanol 96% en un tubo de 5 ml que constituyen el tampón de unión.
      ADVERTENCIA: El tampón de partículas magnéticas contiene azida sódica, que forma un gas tóxico cuando entra en contacto con ácidos o iones de metales pesados y es tóxico si se ingesta o cuando entra en contacto con la piel. Si se ingieres o en contacto con la piel, enjuaga la boca o la piel con abundante agua y busca consejo médico. El etanol es un líquido y vapor altamente inflamable y causa irritación ocular grave. Mantener alejado del calor, superficies calientes, chispas y cualquier otra fuente de ignición. Si entra en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua. En caso de ingestión de grandes cantidades de agua y/o si se inhala, salga al aire libre. En cualquier caso, busque consejo médico.
    2. Añadir 500 l, 600 ml y 200 ml de los tampones de lavado 1, 2 y 3, respectivamente (Tablade materiales),a tres tubos de 2 ml.
      ADVERTENCIA: Los tampones de lavado contienen tiocianato de guanidinio y cloruro de guanidinio, que son dañinos si se inhalan o ingieren e irritan la piel y los ojos. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Si entran en contacto con la piel o los ojos, enjuague con abundante agua. Si se ingiere, enjuague la boca con abundante agua. No induzca el vómito. Siempre busque consejo médico.
    3. Añadir 120 l de tampón de elución (Tablade materiales)a un tubo de 0,5 ml.
  4. Reactivos de detección HAdV y MS2
    NOTA: Se pueden analizar simultáneamente dos reacciones diferentes de extracción de ácido nucleico en cada ensayo de PCR si se utiliza un termociclador de 8 pozos. Para todos los ensayos de PCR, prepare agua de biología molecular alítica en tubos de 1,5 ml.
    1. Detección de HAdV
      1. Preparar una mezcla que contenga 10 ml de imprimación delantera AdF de 22,5 m, 10 ml de imprimación inversa AdR de 22,5 m y 5 ml de sonda AdP de 11,25 m (Tabla 2).
      2. Agregue 2,5 l de la mezcla a los tubos 1 a 8 de una tira de tubo. Dejar secar a temperatura ambiente, cerrar los tubos y mantenerlos protegidos de la luz.
      3. Cortar la tira dividiéndola en dos tiras: tubos 1-5 y tubos 6-8.
      4. Preparar una dilución en serie de suspensiones de ADN que contenga la secuencia de nucleótidos de la región amplificada del VHD. Secado al aire 1 l de suspensiones que contienen 1 x 105, 1 x 107y 1 x 109 GC/ml en tubos 6-8.
        NOTA: Mantenga protegidos de la luz los tubos que contienen las imprimaciones, la sonda y las suspensiones secas al aire.
    2. Detección de MS2
      1. Preparar una mezcla que contenga 10 ml de imprimación delantera de pecson-2F de 25 m, 10 ml de imprimación inversa de pecson-2R de 25 m y 2,5 ml de sonda PecP-2 de 25 m (Tabla2).
      2. Agregue 2,25 l de la mezcla a los tubos 1 a 8 de una tira de tubo. Dejar secar a temperatura ambiente, cerrar los tubos y mantenerlos protegidos de la luz.
      3. Cortar la tira dividiéndola en dos tiras: tubos 1-5 y tubos 6-8.
      4. Proceda como en el paso 1.4.1.4 pero utilice una suspensión estándar diseñada para MS2 en su lugar.

2. Concentración viral

NOTA: Utilice guantes en todo momento durante los procedimientos de recogida de muestras, preparación de reactivos, floculación, recogida de flocs y eliminación de residuos. Use gafas protectoras durante el procedimiento de preparación del reactivo.

  1. Recogida de muestras
    1. Recoger una muestra de agua de 10 L en un cubo de fondo plano con una tapa. Recopile un mínimo de dos réplicas para cada muestra.
      NOTA: Es importante utilizar cubos claros para visualizar el pellet. Si la muestra de agua contiene material suspendido (por ejemplo, arena, algas), deje que se sedimente y, a continuación, recoja el agua sobrenadante en un cubo nuevo.
    2. Registre el volumen recogido, así como la ubicación y la fecha de recogida, para cada muestra de agua.
    3. Coloque un agitador magnético conectado a una batería debajo de un soporte de cucharón y coloque el cubo que contiene la muestra de agua en su soporte.
      NOTA: Busque una superficie plana en un lugar fresco y mantenga los cubos que contienen las muestras de agua de la luz solar directa.
  2. Preparación de reactivos
    1. reactivos de ajuste de pH
      1. Vierta el polvo de ácido cítrico y los pellets de hidróxido de sodio en las macetas que contengan 25 y 50 ml de agua destilada, respectivamente.
      2. Agitar suavemente a mano hasta que el ácido cítrico y el hidróxido de sodio se disuelvan por completo.
        ADVERTENCIA: No vierta el agua sobre los pellets de hidróxido de sodio. En su lugar, vierta los gránulos de hidróxido de sodio sobre el agua.
    2. Leche desnatada preflocuada
      1. Coloque una bolsa de pie en un agitador magnético y vierta 500 ml de agua destilada en ella. Suelte un imán de agitación dentro de la bolsa y encienda el agitador magnético.
      2. Vierta el contenido de un sobre de sal marina y de un tubo de leche desnatado en la bolsa de pie y revuelva durante 5 minutos a velocidad media para disolverlos.
      3. Añadir 3 ml de ácido cítrico a la solución de PSM utilizando una pipeta Pasteur para asegurarse de que el pH se encuentra entre 3,4 y 3,6. Mida el pH de la solución PSM utilizando tiras indicadoras de pH. Añadir cantidades más pequeñas de ácido cítrico e hidróxido de sodio a medida que el pH se acerca a 3.5.
      4. Apague el agitador magnético y asegúrese de que los flocs estén visibles. Utilice una linterna para ayudar a visualizar los flocs.
  3. Floculación
    1. Suelte un imán de agitación en el agua, ajuste el agitador magnético a la velocidad máxima y enciéndalo. Asegúrese de que el imán de agitación comience a girar.
    2. Añadir 10 ml de agua destilada a un tubo de control de proceso. Invierta el tubo varias veces para rehidratar el stock viral y verter la solución en el agua.
    3. Vierta el contenido de un sobre acondicionador de muestra en el agua y revuelva durante 5 min.
    4. Mida el pH de la muestra de agua utilizando tiras indicadoras de pH. Agregue unas gotas de ácido cítrico o hidróxido de sodio a la muestra de agua para asegurarse de que el pH se encuentra entre 3,4 y 3,6. Añadir cantidades más pequeñas de ácido cítrico e hidróxido de sodio a medida que el pH se acerca a 3.5.
    5. Agregue 100 ml de la solución PSM utilizando un contenedor de 100 ml.
    6. Selle el cubo con la tapa, ajuste el agitador magnético a una velocidad mínima y deje el agua agitando durante 8 h.
    7. Apague el agitador magnético y deje que el agua se descanse durante al menos 5 h para permitir que los flocs se asienten.
  4. Colección Floc
    1. Construir un sistema de sifón compuesto por un controlador de pipeta, dos pipetas y un tubo de plástico, para aspirar el agua sobrenadante para descargar el agua en los flocs.
      1. Conecte una pipeta de 10 ml de extremo de cinta al controlador de pipeta. A continuación, coloque la punta de la pipeta en el tubo de plástico.
      2. Retire el filtro de una pipeta de punta abierta de 10 ml con pinzas y conecte la pipeta al tubo de plástico.
    2. Coloque un cubo vacío en el suelo.
    3. Sumerja la punta de la pipeta de punta abierta en el agua. Asegúrese de mantenerlo cerca de la superficie del agua para evitar perturbar los flocs. Aspirar el sobrenadante de agua hasta que llegue a la pipeta de la cinta.
    4. Pellizque el tubo de plástico por el extremo unido a la pipeta de la tapa de cinta y despártelo de la pipeta.
    5. Coloque el tubo en un cubo vacío. Suelte la presión en el tubo para dejar que el agua fluya hacia el cubo vacío.
    6. Pellizque el tubo de plástico para detener el flujo de agua cuando el nivel del agua está a punto de alcanzar el imán de agitación y alejar la pipeta del cubo.
    7. Agitar el cubo para resuspender los flocs y verterlos en una bolsa de plástico de pie de 500 ml. Deje que los flocs se conformen con 1 h más.
    8. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de agua con una pipeta de 50 ml y un controlador manual de pipetas, evitando molestar a los flocs.
    9. Aspirar los flocs usando una pipeta de 100 ml y transferirlos a un tubo de centrífuga graduado de 50 ml. Anote el volumen final del concentrado de muestra y transfiera 1 ml de él a un tubo de 5 ml que contenga la solución conservante, utilizando una pipeta Pasteur.
      NOTA: Es importante que el tubo de centrífuga se gradúe para que el volumen final de la muestra concentrada se pueda medir con la mayor precisión posible y registrarse.
    10. Realizar la extracción de ácido nucleico en el campo. Alternativamente, guarde la solución conservante que contiene los virus a 20-30 oC durante un máximo de 15 días o envíelos a un laboratorio de referencia para su posterior análisis.
  5. Eliminación de residuos y reutilización de materiales
    1. Agregue el contenido de un sobre de agente neutralizante al cubo que contiene el agua descartada. Mezclar el agua, y luego, dejarlo quieto durante 30 minutos.
    2. Deseche el agua tratada como residuo general.
    3. Coloque las pipetas y el tubo de plástico dentro del cubo. Llene el cubo con agua y vierta el contenido de un sobre de agente neutralizante.
    4. Lávelos durante al menos 30 minutos para esterilizarlos y enjuáguelos con abundante agua limpia para eliminar cualquier agente neutralizante restante.

3. Extracción de ácido nucleico

NOTA: Use guantes y use siempre gafas protectoras durante el procedimiento de extracción de ácido nucleico.

  1. Funcionamiento de la pipeta magnética
    1. Familiarícese con el funcionamiento de la pipeta magnética antes de realizar la extracción.
  2. Extracción de ácido nucleico
    1. Organice los tubos que contienen los reactivos necesarios para la extracción en un bastidor, de izquierda a derecha: búfer de unión, tampones de lavado y tampón de elución. Establezca el número adecuado de tubos de acuerdo con el número de muestras o réplicas que se están analizando.
    2. Transfiera 1 ml de concentrado de muestra al tubo que contiene el tampón de unión, utilizando una pipeta Pasteur desechable. Invierta el tubo de 8x a 10x para homogeneizar la solución.
    3. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos mientras se mezcla continuamente, ya sea utilizando un orbital alimentado por energía solar o manualmente.
    4. Recoger las partículas magnéticas utilizando la pipeta magnética y una punta limpia, que se puede reutilizar para los tres tampones de lavado.
    5. Suelte las partículas magnéticas en el tubo que contiene 500 ml de tampón de lavado 1. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
    6. Transfiera las partículas magnéticas al tubo que contiene 600 ml de tampón de lavado 2. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
    7. Transfiera las partículas magnéticas al tubo que contiene 200 ml de tampón de lavado 3. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante 30 s y recórtelos.
    8. Suelte las partículas magnéticas en el tubo que contiene el tampón de elución y deseche la punta.
    9. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 5 minutos mientras se mezcla continuamente, utilizando el orbital alimentado por energía solar.
      NOTA: Mezclar las partículas magnéticas en el búfer de elución es un paso crucial. En caso de falta de un orbital, mezcle continuamente a mano durante el tiempo de incubación.
    10. Sustituya la punta de la pipeta magnética por una nueva y recoja las partículas magnéticas del búfer de elución. Asegúrese de eliminar completamente las partículas magnéticas del tampón de elución, ya que pueden interferir con los métodos de detección molecular.
    11. Deseche la punta con las partículas unidas a ella. Proceda con el análisis de PCR, envíe el búfer de elución a un laboratorio de referencia o almacene el búfer de elución a 4 oC para su posterior análisis.

4. Detección viral con un termociclador en tiempo real de ocho tubos a batería

NOTA: Use guantes y use siempre gafas protectoras durante el procedimiento de detección de ácido nucleico. Sustituya los guantes por otros nuevos al realizar un nuevo experimento de PCR para evitar la contaminación cruzada.

  1. PCR cuantitativo HAdV
    1. Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 2, 4 y 5.
    2. Añadir 4 l de mezcla de PCR a los tubos 1-5.
    3. Añadir 14 l de extracción de ácido nucleico de la muestra A al tubo 1 y 14 l de la muestra B al tubo 3.
    4. Añadir 2 l de ácidos nucleicos extraídos de la muestra A al tubo 2 y 2 l de la muestra B al tubo 4. Cierre la tira de cinco tubos.
    5. Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 6, 7 y 8.
    6. Agregue 4 l de esta mezcla a los tubos 6, 7 y 8, y ciérrelos.
    7. Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione el funcionamiento adecuado (Tabla3).
    8. Deseche el tubo de agua y mantenga el ácido nucleico extraído en el congelador, si es posible, o, si no, en un lugar fresco protegido de la luz en caso de que sea necesario realizar una segunda prueba.
    9. Limpie las micropipetas, el bastidor, el material de trabajo y todo el material correctamente con un limpiador de ácido nucleico y deseche la bolsa de plástico que contenga la punta, guantes y tubos usados.
      ADVERTENCIA: El removedor de ácido nucleico es un líquido y vapor muy inflamable. No respirar la niebla de pulverización y evitar cualquier contacto del líquido con los ojos o la piel. De lo contrario, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico.
    10. Recopilar los resultados y analizar los datos obtenidos.
  2. PCR cuantitativo MS2
    1. Añadir 14 l de agua sin nucleasas a los tubos 2, 4 y 5.
    2. Añadir 4 l de mezcla de PCR y 0,5 l de enzima transcriptasa inversa a los tubos 1-5.
    3. Añadir 14 l de extracción de ácido nucleico de la muestra A al tubo 1 y 14 l de la muestra B al tubo 3.
    4. Añadir 1 l de ácidos nucleicos extraídos de la muestra A al tubo 2 y 1 l de la muestra B al tubo 4. Cierre la tira de cinco tubos.
    5. Agregue 15,5 l de agua libre de nucleasas a los tubos 5, 6, 7 y 8, y ciérrelos.
    6. Añadir 4 l de mezcla de PCR y 0,5 l de enzima transcriptasa inversa a los tubos 6, 7 y 8.
    7. Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione el funcionamiento adecuado (Tabla3).
    8. Proceda como se describe en los pasos 4.1.8 a 4.1.10.

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Resultados

Desarrollo de métodos

Este procedimiento ha sido desarrollado en el Laboratorio de Virus Contaminantes del Agua y Alimentos con la colaboración de GenIUL y Oxfam Intermón. Consta de tres pasos diferentes. La primera, la concentración de partículas virales, es una adaptación de un método de floculación de leche desnatada descrito anteriormente12,17,<...

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Discusión

El método VirWaTest permite la concentración de virus y la extracción de ácido nucleico de muestras de agua en el punto de uso por usuarios no experimentados. Es un protocolo asequible, rápido y simple. La concentración se basa en el principio de la floculación orgánica utilizando leche desnatada, por el cual el bajo pH y las condiciones de alta conductividad hacen que las proteínas de leche desnatadas se acumulen en flocs los virus adsorbe. Cuando el sedimento flocs, es fácil de recoger, lo que permite concentrar 10 L d...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

VirWaTest fue un proyecto de investigación financiado por el programa HIF (Humanitarian Innovation Funds) de ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Los autores reconocen a los equipos de WASH que amablemente colaboraron en este estudio. El análisis de muestras en Ecuador fue financiado por Oxfam Ecuador y Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Américas (AMB). BRT.17.01). S. Bofill-Mas es serra-hunter becarios en la Universidad de Barcelona.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Incluye 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix) de Solis Biodyne, 50 reacciones
Tiras de 8 microtubos con tapasdD Biolab840637perfil bajo, paredes delgadas, adaptadas para PCR cuantitativa y cualitativa
Baterías y adaptadores de corriente para agitador magnéticoGenIUL900011674incluye alimentación de coche de 12 V adaptador
Soporte de cucharónGenIUL900011648Soporte de aluminio
Cucharón, 10 LCater4You10LTRPolipropileno, a prueba de manipulaciones, color transparente
Tubo de centrífuga, 50 mLLabBoxCTSP-E50-050Polipropileno, estéril, graduado, con faldón
Ácido cítrico 1-hidrato, 500 gPanReac AppliChem1410181211Pure, Grado Farmacéutico, 1 Kilogramo
Botella de PET transparenteLabBoxFPET-500-088Color transparente, PET, tapón no incluido
Leche desnatada Difco, 500 gBecton Dickinson232100deshidratado
, 250 mLZymo ResearchR1100-250Medio de conservación de ADN/ARN, 250 mL
Controlador de pipeta Easy9 LabBoxEAS9-001-0010,3 y mu; Filtro m, Pipetas de 0,1 a 100 mL, Soporte para pipetas de silicona esterilizable en autoclave
Tubo Eppendorf, 0,5 mLEppendorf0030121023Polipropileno, Safe-Lock
Tubo Eppendorf, 2 mLEppendorf0030120094Polipropileno
, Tubo Eppendorf Safe-Lock, 5mL dD Biolab999542Polipropileno, estéril, etanol graduado
96% V/V, 1 LPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  y HPLC
LabBoxFORS-007-002Extremo fino, curvo, L= 120 mm
Agitador magnéticoGenIUL900017000
RotuladordD Biolab 929203Negro, Punta extrafina, resistente al agua, de secado rápido, para plástico y cristalería
Micro Rota-Rack para MicrotubosdD Biolab377824 Módulos, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Ciclo de PCR en tiempo realCoyote Biosciences, ChinaMini-8Portátil, Funciona con Fuentes de Alimentación de 12V o Baterías Externas, Dos Canales, Capacidad para 8 Tubos
Tampón de Lisis NucliSensBiomerieux200292Reactivos para hasta 48 Aislamientos, Almacenamiento a Temperatura Ambiente
Pipeta Serológica de Punta Abierta, 10 mLDeltalab900136Nestéril, envuelto individualmente (papel/plástico)
Tapón de rosca de PE PP28LabBoxTP28-004-020para botellas de PET
tira indicadora de pHLabBoxWSPH-001-001 Rango depH 2.8 a pH 4.4, 50 tiras por paquete Tubo de ensayo de
plásticoQuimikals300913incluye tapa
Pipeta de polietileno PasteurLabBoxPIPP-003-500graduada, 7 mL de volumen total,
rosca de polipropileno no estéril con tapón de rosca, 150 mLDeltalab409726Tapón de rosca, estéril, graduado hasta 100 mL
Matraz de rosca de polipropileno con tapón de rosca, 60 mLDeltalab409526GTapón de rosca, estéril, graduado hasta 50 mL
Detergente en polvoJabón en polvo regular para lavar la ropa
Cables de alimentación para agitador magnéticoGenIUL900011692Conexión entre baterías y agitadores magnéticos
Herramienta magnética QuickPickBioNobile24001Herramienta manual para partículas magnéticas
QuickPick Tips in BoxBioNobile24296Sin RNasa, Autoclave, 96 Unidades
QuickPick XL gDNA Partículas MagnéticasBioNobileSN511003.2 mL
Sales MarinasSigma-AldrichS9883-500GUna mezcla de sales artificiales muy parecida a la composición de las sales disueltas del agua del océano
Tubo de siliconaLabBoxSILT-006-005Rollo de 5 metros, interior  ø x exterior  ø= 6 x 10 mm
Pellets de hidróxido de sodio, 98,5 - 100,5%VWR Chemicals 28244295Pellets, 1 kg
Plataforma giratoria solarSOL-EXPERT Group70020Placa acrílica, 10 RPM, admite hasta 300 gramos
Kit de sonda SOLIScript de 1 pasoSolis BioDyne08-57-00250Incluye 5 mezclas de sonda de un solo paso (qPCR Mix) y 40 mezclas SOLIScript de un solo paso (enzima de transcriptasa inversa), 250 reacciones
Kit de extracción de virus de ARN SPEEDTOOLSBioTools21.141-4197Incluye el tampón BAW (tampón de lavado 1), el tampón BAV3 (tampón de lavado 2 y 3) y el tampón BRE (tampón de elución) de BioTools.
Imán Agitador OcthaedralSpinBar dD Biolab 045926Anillo de pivote, L x  ø = 38 x 8 mm,
Azul Pipeta serológica con extremo de cinta, 10 mLDeltalabPN10E1Estéril, envuelta individualmente (papel/plástico)
Pipeta serológica de extremo de cinta, 50 mLDeltalab900043estéril, envuelta individualmente (papel/plástico)
Termi-DNA-Tor - Removedorde ácido nucleicoBioTools22001-4291Removedor de ácidos nucleicos, bacterias, hongos y micoplasmas de materiales y superficies, 450 mL
de agua Reactivo de biología molecular, 1LSigma-AldrichW4502-1L Libre denucleasa y proteasa, 0.1 μ m Bolsa
Whirl-Pak filtrada, 540 mLDeltalab200361Bolsa
lisa con cierre hermético con cierreLabBoxBZIP-080-100Polietileno, largo x ancho = 120 x 80 mm
de Escudo de ADN/ARN Para pinzas de laboratorio a pilas Matraz de - hermético de fondo estable

Referencias

  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

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