Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La talidomida de los fármacos inmunomoduladores (IMID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, inducen ubiquitinación y degradación de los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) a través de la ligasa de ubiquitina cereblon (CRBN) E3 para la degradación proteasomal. Los IMID se han utilizado recientemente para la generación de proteólisis bifuncional dirigida a quimeras (PROTAC) para apuntar a otras proteínas para la ubiquitinación y la degradación proteasomal por la ligasa CRBN E3. Diseñamos y sintetizamos PROTACfuncionales basados en pomalidomida y analizamos su capacidad para inducir la ubiquitinación autodirigida y la degradación de CRBN. Aquí, CRBN sirve como ambos, la ligada a la ubiquitina E3 y el objetivo al mismo tiempo. El compuesto homo-PROTAC 8 degrada CRBN con una alta potencia con sólo efectos restantes mínimos sobre IKZF1 e IKZF3. La inactivación de CRBN por compuesto 8 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular y la proliferación de diferentes líneas celulares de mieloma múltiple. Este homo-PROTAC deroga los efectos de los ID En múltiples células de mieloma. Por lo tanto, nuestros compuestos homodíricos a base de pomalidomida pueden ayudar a identificar los sustratos endógenos y las funciones fisiológicas de CRBN e investigar el mecanismo molecular de los IMID.
Introducción
La litimida de los fármacos inmunomoduladores (IID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos aprobados para el tratamiento del mieloma múltiple, se unen a la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), un adaptador de sustrato para cullin4A-RING E3 ubiquitina ligerina (CRL4CRBN)1,2,3. La unión de los IMID mejora la afinidad de CRL4CRBN con los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), lo que lleva a su ubiquitinación y degradación (Figura1)4,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de moléculas PROTAC
ADVERTENCIA: Consulte todas las fichas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Utilice todas las prácticas de seguridad y equipos de protección personal adecuados.
- Preparación de carbamato tert-butilo N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)(compuesto 1)
- Añadir 1,1'-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) y una cantidad catalítica de 4-(dimetilamino)piridina (5 mg) a una mezcla de Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en matraz de fondo redondo ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Aquí describimos el diseño, síntesis y evaluación biológica de un PROTAC homodimérico basado en pomalidomida para la degradación de CRBN. Nuestro PROTAC interactúa simultáneamente con dos moléculas CRBN y forma complejos ternarios que inducen la autoubiquitinación y la degradación proteasomal de CRBN con sólo efectos mínimos restantes sobre neo-sustratos inducidos por pomalidomida IKZF1 o IKZF3.
De una serie de moléculas PROTAC<.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El diseño de tales homo-PROTAC como se describe aquí para CRBN se basa en la afinidad específica de la pomalidomida con CRBN, que se ha utilizado con éxito en numerosos PROTAC heterobifuncionales y dio lugar al desarrollo de PROTAC 8 como un altamente degradador selectivo de CRBN. La especificidad de nuestra molécula ya ha sido confirmada por los análisis proteómicos24. Para el knockout genéticamente mediado, la exclusión y validación de los efectos secundarios es difícil y requie.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran un posible conflicto financiero de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 y SFB-1074 a J.K.; FOR2372 a M.G.)
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,1'-carbonildiimidazol | TCI productos químicos | C0119 | |
| 2,2′-(Etilendioxi)-bis(etilamina) | Sigma-Aldrich | 385506 | compuesto 6 |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-anhídrido fluoroftálico, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-dimetilaminopiridina, 99 % | Acros | 148270250 | |
| Acrilamidas tóxicastammlö sung/ Bisacrilamida (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) | mAB Señalización | 15103S | |
| Anticuerpo anti-CRBN producido en conejo | Sigma | HPA045910 | |
| Anticuerpo anti-conejo IgG ligado a HRP | Sigma | 7074S | |
| Persulfato de amonio | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | Productos químicos TCI | B1649 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad de células luminiscentes | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhidro, 99,8 % | Acros | 348435000 | Extra seco sobre tamiz molecular |
| DMSO, anhidro, 99,7 % | Acros | 348445000 | Extra Seco sobre Tamiz Molecular |
| Glicina | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Cabra anti-ratón (HRP conjugado) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Inhibidor de la fosfatasa Cóctel de un solo uso (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) | Señalización de células | 14859S | |
| Membrana de transferencia ImmobilonP (0,45µ m) | Merck | IPVH000010 | |
| Yodometano, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Metanol altamente tóxico |
| Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | ||
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini celda de transferencia electroforética Trans-Blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (caimán) | Cay15217-1 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-&alfa;-tubulina producido en ratón (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-etildiisopropilamina, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Leche en polvo descremada | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell Blanco Placa de poliestireno | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Tampón de muestra (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomida | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Tampón de decapado Western Blot | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodio sulfato de dodecilo | Carl Roth | 183.1 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| terc-butilo N-[2-[2-(2--(2-aminoetoxi)etoxi]etil]carbamato | Sigma-Aldrich | 89761 | Compuesto 5 |
| Tricina | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
Referencias
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferati....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
