Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Resumen

Aquí describimos los protocolos para aplicar cargas mecánicas definidas a los terneros de ratón y para monitorear los cambios de presión intramusculares concomitantes. Los sistemas experimentales que hemos desarrollado pueden ser útiles para investigar el mecanismo detrás de los efectos beneficiosos del ejercicio físico y el masaje.

Resumen

El masaje es generalmente reconocido para ser beneficioso para aliviar el dolor y la inflamación. Aunque estudios anteriores han reportado efectos antiinflamatorios del masaje en los músculos esqueléticos, los mecanismos moleculares detrás son mal entendidos. Recientemente hemos desarrollado un dispositivo simple para aplicar compresión cíclica local (LCC), que puede generar ondas de presión intramusculares con diferentes amplitudes. Usando este dispositivo, hemos demostrado que LCC modula las respuestas inflamatorias de los macrófagos in situ y alivia la atrofia muscular inducida por inmovilización. Aquí, describimos los protocolos para la optimización y aplicación de LCC como una intervención similar a un masaje contra la inflamación inducida por la inmovilización y la atrofia de los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores del ratón. El protocolo que hemos desarrollado puede ser útil para investigar el mecanismo subyacente a los efectos beneficiosos del ejercicio físico y el masaje. Nuestro sistema experimental proporciona un prototipo del enfoque analítico para dilucidar la regulación mecánica de la homeostasis muscular, aunque es necesario seguir desarrollando para estudios más exhaustivos.

Introducción

Masaje es generalmente reconocido para ser beneficioso para el alivio del dolor y la mejora del rendimiento físico entre los atletas competitivos y no atletas por igual^1,2. De hecho, estudios previos han demostrado que el masaje suprime la inflamación local³ y provoca la recuperación del daño muscular post-ejercicio^4,5. Los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos beneficiosos del masaje siguen siendo en gran medida desconocidos.

Una de las dificultades con la investigación mecanicista sobre el masaje se refiere a la reproducibilidad de las técnicas experimentales mediante las cuales se prueban intervenciones similares a los masajes. En estudios anteriores, los procedimientos experimentales que imitan el masaje implican principalmente la aplicación de intervenciones físicas utilizando las partes del cuerpo de los practicantes, como palmas y dedos^6,7,8. Esto hace que sea difícil reproducir con precisión su magnitud, frecuencia, duración y modo.

Muchos dispositivos han sido desarrollados para aplicar cargas mecánicas definidas a los tejidos objetivo. Por ejemplo, Zeng y otros han desarrollado un sistema neumático para la carga mecánica longitudinal a las patas traseras de las ratas⁹ y Wang et al. han desarrollado un dispositivo mecatrónico que puede aplicar cargas mecánicas similares a un masaje a las extremidades posteriores de ratas y conejos con control de retroalimentación en tiempo real¹⁰. En comparación con ellos, nuestro sistema de compresión cíclica local (LCC) es mucho más simple, exigiendo mucho menos costo para la construcción. Sin embargo, podemos reproducir los cambios de presión intramuscular que se generan durante la contracción muscular leve. Usando este dispositivo, hemos demostrado con éxito que las intervenciones mecánicas similares al masaje modulan la dinámica local del fluido intersticial y alivian la atrofia muscular inducida por la inmovilización^11.

Aquí, describimos los detalles de nuestro dispositivo y el protocolo, que pueden ayudar a explorar los mecanismos moleculares detrás de los efectos positivos de los ejercicios y masajes. Los esquemas del protocolo se presentan como Figura Suplementaria 1.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Rehabilitación para Personas con Discapacidad.

1. Inmovilización de las extremidades posteriores bilaterales del ratón

NOTA: Los ratones machoC57BL/6 se utilizaron para experimentos a la edad de 11 - 12 semanas después de la aclimatación durante al menos 7 días.

1. Anestesiar adecuadamente un ratón con pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.). Asegúrese de que los ratones no respondan a un pellizco del dedo del dedo del pies de la extremidad posterior.
   NOTA: Llevar a cabo el procedimiento de inmovilización entre las 10 a.m. y las 7 p.m. para minimizar los posibles efectos en la actividad de alimentación de los ratones.
2. Aplique cintas quirúrgicas a las extremidades posteriores bilaterales del ratón colocadas en una posición supina con las articulaciones de la rodilla extendidas y las articulaciones del tobillo plantar-flexibles.
3. Coloque un alambre de aluminio (ver Tabla de Materiales)en el tronco a nivel de la columna vertebral L4-5 y enrolle el alambre en una configuración en espiral alrededor de las extremidades posteriores con espacios de 5 mm entre cada vuelta de la capa espiral(Figura 1A). Asegúrese de no enrollar el cable demasiado firmemente y evitar perturbar el flujo sanguíneo local.
4. Para minimizar la posibilidad de escape del cableado, inmovilice las articulaciones de la cadera en la posición de abducción de 90o ajustando manualmente la configuración del cable de aluminio.
5. Devuelva a los ratones a sus jaulas originales. 3 h más tarde, asegúrese de que se recuperan de la anestesia y el acceso a los alimentos y el agua como de costumbre.
6. Casa 3 - 6 ratones inmovilizados por jaula como antes de la inmovilización.

2. Medición de la presión intramuscular de los músculos del ratón gastrocnemius

NOTA: Varios pesos diferentes de unidades cilíndricas (36 g, 66 g y 200 g) se probaron en los experimentos de monitoreo de presión combinados con LCC. Esta medición se llevó a cabo por separado de los experimentos para analizar la inflamación muscular y la atrofia (ver paso 3 - 5 para más detalles), es decir, los ratones sometidos a medición de presión no se utilizaron para análisis histológicos.

1. Debido a que la medición de la presión implica procedimientos más invasivos (por ejemplo, incisión cutánea e inserción de agujas) en comparación con el cableado de las extremidades posteriores y LCC, utilice una mezcla de tres agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg y butorphanol 5,0 mg/kg, i.p.). Asegúrese de que los ratones no respondan al pellizco del dedo del pito trasero.
2. Colocar el ratón en una posición propensa, hacer una incisión de 2 mm con un bisturí en la pantorrilla posterior después de depilar con una afeitadora eléctrica y semi-esterilizar la superficie de la piel con 70% de etanol y clorhexidina-empapado de algodón absorbente.
3. Inserte una aguja de 20 G en el músculo gastrocnemius en un ángulo obtuso (150o – 170o) hacia la superficie de la piel.
4. Usando la vaina de plástico de la aguja como guía, coloque un sensor del temímetro de presión arterial (ver Tabla de Materiales)en el vientre medio del músculo gastrocnemius, y luego retire la vaina del músculo.
5. Después de suturar la piel con sutura de nylon 4-0, aplicar LCC con varios pesos diferentes de unidades cilíndricas a la pantorrilla en los ratones (ver paso 3 para más detalles), y controlar la presión intramuscular utilizando software para el análisis de señal biológica (ver Tabla de Materiales).
6. Devuelva a los ratones a sus jaulas originales. 3 h más tarde, asegúrese de que se recuperan de la anestesia / analgesia y tienen acceso a alimentos y agua como de costumbre.

3. Compresión cíclica local (LCC) en terneros de ratón

1. Excepto para la medición de la presión intramuscular y la eutanasia (es decir, la luxación cervical), utilice pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) para la anestesia.
2. Desconecte el ratón del cableado de las extremidades posteriores y colóquelo en una posición propensa con las articulaciones de la rodilla extendidas y las articulaciones del tobillo plantar-flexibles de modo que las pantorrillas se enfrentaran hacia arriba. No fije las patas traseras del ratón en el escenario.
3. Aplique LCC a la pantorrilla moviendo verticalmente una unidad de peso cilíndrico(Figura 1B)cubierta con una almohadilla de cojín(Figura 1C)a 1 Hz durante 30 min por día, 7 días.
4. Después de cada pelea de LCC diario, vuelva a cablear las extremidades posteriores del ratón.

4. Análisis inmunohistoquímico de gastrocnemius

1. Eutanasia del ratón mediante luxación cervical bajo anestesia/analgesia adecuada mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de tres agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg y butorphanol 5,0 mg/kg).
2. Después de depilar la superficie posterior de la pantorrilla, haga una incisión cutánea y diseccione los músculos gastrocnemius separándose del hueso tibio-fibular usando una tijera quirúrgica y congele rápidamente en una solución compuesta de temperatura de corte óptima.
3. Con un criostato, prepare muestras de criosección de los músculos gastrocnemius en diapositivas de vidrio. Almacene las muestras en un congelador de -80 oC hasta su análisis.
4. Saque las muestras de criosección gastrocnemius que se analizarán del congelador y deshidratalas por secado al aire a temperatura ambiente.
5. Utilice una pluma bloqueadora de líquidos para dibujar un área que incluya todas las criosecciones de la diapositiva. El círculo evitará que las soluciones fluyan fuera de la diapositiva.
6. Evite el secado de las muestras colocando los portaobjetos en una bandeja en la que se cree un ambiente húmedo con un paño de papel empapado en agua.
7. Aplicar 100 l de tampón de bloqueo (salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,25% de caseína, proteína portadora y azida sódica de 0,015 M) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
8. Enjuague las diapositivas dos veces incubando con PBS-T (PBS que contiene 0,1% monolaurato de sorbitano de polioxietileno (ver Tabla de Materiales)durante 5 min.
9. Aplicar 100 s de anticuerpo primario diluido con PBS en cada muestra, cubrir la bandeja con una tapa e incubar durante la noche a temperatura ambiente.
10. Lavar 3 veces con PBS-T (5 min por cada lavado).
11. Aplicar 100 éL de anticuerpo secundario diluido con PBS en cada muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Para la tinción anti-laminina, utilice anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor 568. Para anticuerpos secundarios anti-F4/80, anti-MCP-1 y anti-TNF,, utilice Alexa Fluor 568- o 488-conjugado anticuerposecundario.
12. Lavar 3 veces con PBS-T (5 min por cada lavado).
13. Aplicar 100 l de solución DAPI diluida con PBS-T en cada muestra e incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
14. Lavar 3 veces con PBS-T (5 min para cada uno).
15. Monte las muestras con un medio de montaje y cúbralas con tapas.

5. Análisis histomorfométrico del gastrocnemio

1. Coloque los portaobjetos de muestra en un microscopio de fluorescencia (ver Tabla de Materiales)y vea las muestras utilizando un objetivo de 20o con filtros apropiados (DAPI-B, 360/40 nm para excitación y 460/50 nm para la emisión; GFP-B, 470/40 nm para excitación y 535/50 nm para emisión; FRITC, 540/25 nm para excitación y 605/55 nm para emisión.
2. Usando el software para el análisis de imágenes (ver Tabla de Materiales),mida el área transversal (CSA) de cada miofibra, y cuente el número de células f4/80-, MCP-1-, y TNF--positivas.
   NOTA: Determinar la CSA de cada miofibra trazando el margen interno de la membrana del sótano visualizado con inmunomancha anti-laminina-2.

Resultados

En consonancia con nuestras observaciones anteriores¹², la CSA de las miofibras gastercnemius se redujo significativamente por la inmovilización de las extremidades posteriores(Figura 2A,B). Además, nuestro análisis de tinción de inmunofluorescencia reveló que las células que expresan MCP-1 y TNF-o, que desempeñan un papel clave en la regulación de los procesos inflamatorios^13,14, aumentaron s...

Discusión

Hemos descrito un método para aplicar un estímulo mecánico similar al masaje, que tiene efectos antiinflamatorios. Nuestro sistema tiene ventajas de seguimiento incluso en comparación con las reportadas anteriormente. En primer lugar, estudios anteriores no definieron cuantitativamente las fuerzas mecánicas aplicadas² o definieron sus magnitudes en función de la medición en la superficie corporal, pero no dentro de los tejidos¹⁰. Por el contrario, medimos la presión intramu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alambre de aluminio	DAISO JAPAN	B028	Se utiliza un alambre de aluminio para evitar escapar de la restricción del cable
Telemetro de presión arterial	Millar	SPR-671	Un telémetro de presión arterial se utiliza para medir la presión intramuscular.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI es una sonda fluorescente que se usa comúnmente para teñir ADN para microscopía fluorescente.
Cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (Relación de dilución, 1:500)	Invitrogen	A11034	Anticuerpo para tinción inmunohistoquímica.
Anti-rata de cabra Alexa Fluor 568 (Relación de dilución, 1:500))	Invitrogen	A11077	Anticuerpo para la tinción inmunohistoquímica.
ImageJ	NIH	N/A	Software de análisis para imágenes
LabChart8	ADInstrumens		Software de análisis para la adquisición de señales biológicas.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold es para el montaje de muestras manchadas.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	Para bloquear la tinción de fondo inespecífica en procedimientos inmunohistoquímicos.
Anticuerpo monoclonal anti-laminina-2 de rata (relación de dilución, 1:1000)	Anticuerpo Sigma Aldrich	L0663	para tinción inmunohistoquímica.
Anticuerpo monoclonal anti-F4/80 de rata (relación de dilución, 1:500)	Anticuerpo Abcam	ab6640	para tinción inmunohistoquímica.
Anticuerpo policlonal anti-MCP-1 de conejo (relación de dilución, 1:1000)	Anticuerpo Abcam	ab25124	para tinción inmunohistoquímica.
Anticuerpo policlonal anti-TNF-&alfa; de conejo (Relación de dilución, 1:1000)	Abcam	ab66579	Anticuerpo para tinción inmunohistoquímica.
Cinta quirúrgica	3M Japan	1530EP-0	La cinta quirúrgica se utiliza para restringir el movimiento de las articulaciones.