Integrina tensión juega un papel importante en diversas funciones celulares. Con un sensor de tensión integradora, integrina tensión es calibrada con sensibilidad picoNewton (pN) y reflejada en la resolución del submicron.
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Artículo de método
Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora
En este artículo
Resumen
Resumen
La tensión molecular transmitida por bonos de integrina ligando es la señal mecánica fundamental en la vía de la integrina que juega un papel importante en muchas funciones celulares y los comportamientos. Para calibrar y tensión de integrina de la imagen con fuerza alta sensibilidad y resolución espacial, se desarrolló un sensor de tensión integradora (ITS), un sensor de tensión fluorescente basado en el ADN. El su se activa para emitir fluorescencia si mantener una tensión molecular, así conversión de fuerza a la señal fluorescente a nivel molecular. El umbral de tensión para su activación es ajustable en el rango de pN 10 – 60 que cubre bien el rango dinámico de tensión de integrinas en las células. Sobre un sustrato injertado con una ITS, la tensión de integrinas de las células adherentes es visualizada por fluorescencia y reflejada en la resolución del submicron. El ITS también es compatible con la proyección de imagen estructural de célula en células fijas y células vivas. El ITS se ha aplicado con éxito al estudio de la migración celular y la contracción de la plaqueta. Este documento detalla el procedimiento para la síntesis y aplicación de lo ITS en el estudio de la fuerza celular integrina-transmitida.
Introducción
Las células dependen de las integrinas cumplir y ejercer fuerzas celulares a la matriz extracelular. Transmisión de fuerza y adhesión celular mediada por integrinas son cruciales para la célula de difusión de1,2, migración3,4y supervivencia5,6,7. En el largo plazo, integrina biomecánica señalización también influye célula proliferación8,9,10 y diferenciación
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC, 8-16-8333-I) de la Universidad Estatal de Iowa.
1. síntesis del sensor tensión integradora
- Personalizar y ordenar ssDNAs (véase la Tabla de materiales).
Nota: Las secuencias de ssDNA son como sigue. El filamento superior es /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG CCG/3BHQ_2 /. Los filamentos más bajos son los siguientes.
12 pN ITS: / 5Cy3/CGG CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
23 pN ITS: / 5Cy3//iBiodT/ CGG CCG CTG CGT CC CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/CG/iBiodT CGG CCG CTG/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/CGG CCG C/iBio....
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Resultados
Con el ITS, el mapa de la tensión de integrina de keratocytes pescado fue capturado. Muestra que un keratocyte migra y genera tensión integrina en dos pistas de fuerza (figura 2A). La resolución del mapa de fuerza fue calibrada para ser 0,4 μm (figura 2B). Integrina alta tensión se concentra en el margen posterior (Figura 3A). El ITS también demuestra diferentes patrones específicos de las diferentes.......
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Discusión
El ITS es muy accesible pero poderosa técnica para celulares asignación en términos de síntesis y aplicación de la fuerza. Con todos los materiales listos, el ITS pueden ser sintetizado dentro de 1 día. Durante los experimentos, se necesitan sólo tres pasos de la capa superficial antes de la galjanoplastia de la célula. Recientemente, lo más habían simplificado el procedimiento de recubrimiento para un paso vinculando directamente el su con albúmina de suero bovino, lo que permite la adsorción física directa de la ITS a .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el fondo de arranque proporcionado por la Universidad Estatal de Iowa y por el Instituto Nacional del General médica Ciencias (R35GM128747).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BSA-biotina | , Sigma-Aldrich, | A8549 | |
| Neutravidina | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Estreptavidina | Thermo Fisher Scientific | ||
| hebra superior, ADN | Tecnologías de ADN integradas | N/A | , Diseñado por el cliente. La secuencia de ADN se muestra en la sección PROTOCOLO, |
| ADN de hebra inferior, Tecnologías | de ADN integradas N | /A | Diseñado por el cliente. Las secuencias de ADN se muestran en la sección PROTOCOLO. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Péptido cíclico RGD con un grupo amina | Péptidos International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicilina | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL placa de Petri | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Espectrómetro | Thermo Scientific | N/A |
| SE410 Unidad alta de electroforesis de proteínas vertical refrigerada por aire | Hoefer | SE410-15-1.5 | Dispositivo para electroporesis |
| Línea celular CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| Línea celular NIH/3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| Anticuerpo anti-vinculina | EMD Millipore | 90227 | Anticuerpo primario para inmunotinción de vinculina |
| Anticuerpo secundario superclonal anticuerpo secundario superclonal anti-IgG (H+L) de ratón de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Anticuerpo secundario para inmunotinción con vinculina |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Microscopio | Eclipse Ti | Nikon | N/A |
Referencias
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal ....
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Reimpresiones y permisos
